楊 開,王玏縈,徐夢(mèng)婷,孫培龍
(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 杭州 310014)
植物甾醇在不同基質(zhì)飲料中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性研究
楊 開,王玏縈,徐夢(mèng)婷,孫培龍
(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 杭州 310014)
將乳化后的植物甾醇按相同添加量加入到牛奶、果汁和果汁乳飲料中,在4, 20, 35 ℃條件下恒溫保存三個(gè)月,每隔一個(gè)月測(cè)定三種飲料中植物甾醇氧化物(POPs)和植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:儲(chǔ)藏期結(jié)束后,35 ℃條件下保存的牛奶中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多,達(dá)(997.09±26.48) μg/g,甾醇損失率達(dá)(25.50±1.03)%,4 ℃保存的果汁乳飲料中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少,為(237.65±16.48) μg/g,甾醇損失率為(2.95±0.37)%.以牛奶為基質(zhì)的飲料中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多,其次是果汁,果汁乳飲料最少.將三種含植物甾醇的飲料在室溫下置于光照和避光條件下保存,儲(chǔ)藏期結(jié)束后,光照組中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯大于避光組.
植物甾醇;飲料;氧化產(chǎn)物;儲(chǔ)藏穩(wěn)定性
植物甾醇是存在于植物中的一種天然物質(zhì),其結(jié)構(gòu)和膽甾醇類似[1].常見的植物甾醇主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等.研究表明:每天服用2 g植物甾醇可以降低血液中10%低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)[2],此外植物甾醇還具有抗炎、抗氧化、抗癌、防止心血管疾病等多種生理活性,被國(guó)際生命科學(xué)學(xué)會(huì)大力推薦為十大功能性食品配料之一[3].目前,植物甾醇已被廣泛應(yīng)用于人造奶油、乳制品、焙烤制品、香腸、植物油、果汁等食品中[4],其中由于植物功能性飲料市場(chǎng)巨大,越來(lái)越多的國(guó)家對(duì)植物甾醇飲料進(jìn)行了研究,美國(guó)可口可樂(lè)飲料公司開發(fā)生產(chǎn)了添加植物甾醇成分的柑橘汁產(chǎn)品[5],英國(guó)TESCO集團(tuán)在英國(guó)市場(chǎng)推出了降膽固醇乳制品,意大利EI公司開發(fā)了名為Sauscol Bianco的含植物甾醇的益生菌飲料[6],植物甾醇在功能性飲料的開發(fā)和應(yīng)用中起著越來(lái)越重要的作用,添加植物甾醇的功能性飲料正形成一股新興的健康熱潮.
天然植物甾醇在在光、熱、氧氣或酶等作用下,會(huì)發(fā)生自身氧化或酶促氧化形成甾醇氧化物(POPs).植物甾醇氧化物的種類主要分為主環(huán)氧化物和側(cè)鏈氧化物,一般會(huì)生成含羥基、酮基、環(huán)氧基和三羥基等結(jié)構(gòu)的主環(huán)氧化物[7].這些氧化產(chǎn)物會(huì)影響到功能性飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而目前我國(guó)對(duì)植物甾醇在食品中穩(wěn)定性的研究和應(yīng)用主要集中在油脂,因此,探究含有植物甾醇功能性飲料的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性是十分必要的.利用植物甾醇制備功能性乳飲料,研究了三種基質(zhì)的飲料在不同儲(chǔ)藏溫度、儲(chǔ)藏時(shí)間和光照條件(光照、避光)下POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化,旨在為功能性飲料的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)根據(jù).
1.1 材料與試劑
植物甾醇:實(shí)驗(yàn)室自制,純度為(93.73±1.06)%,主要成分及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),豆甾醇47.35%,β-谷甾醇32.36%,菜油甾醇15.18%,24-亞甲基膽甾醇5.11%;牛奶(脫脂):市購(gòu);鮮榨果汁(橙子、蘋果):實(shí)驗(yàn)室自制;果汁乳飲料(脫脂乳加鮮榨果汁):實(shí)驗(yàn)室自制;5α-膽甾烷:美國(guó)Sigma公司;正己烷、乙醚:分析純,杭州雙林化工試劑廠;色譜級(jí)正己烷:阿拉丁試劑(上海)有限公司.
1.2 儀器與設(shè)備
Thermo Scientific氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:型號(hào)Thermo ISQ單四極桿,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;超高溫瞬時(shí)滅菌機(jī):PT-20T型,上海沃迪科技有限公司;打漿機(jī):SKG1354,佛山艾詩(shī)凱奇電器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱:DRP-9002,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;固相萃取儀:W-SPE 12,北京萊伯泰科儀器股份有限公司;氮吹儀:HN200(24孔),濟(jì)南海能儀器股份有限公司;雙光束紫外可見分光光度計(jì),TU-1900,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 植物甾醇乳液的制備
稱取三聚甘油單硬脂酸酯和蔗糖脂肪酸酯(質(zhì)量比為1∶2)的混合乳化劑于燒杯中,量取去離子水倒入燒杯配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的乳液,在70 ℃條件下用磁力攪拌器攪拌至完全溶解并形成水相.將油菜花粉甾醇緩慢加入水相,配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的甾醇乳液,用高速剪切機(jī)均質(zhì)形成水包油型甾醇粗乳液.乳化后的乳狀液一般以眾多分散的粒子形式存在,因此需采用高壓均質(zhì)機(jī)在75 MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)后得到水包油型甾醇乳液.
1.3.2 樣品的制備
由于植物甾醇不溶于水,因此將植物甾醇乳化后加入飲料中,配制成油包水型甾醇乳液.
分別在脫脂乳、果汁和果汁乳飲料中加入甾醇乳液,制備成含有5 g/L植物甾醇的功能性飲料,將三種樣品置于超高溫瞬時(shí)滅菌機(jī)中115 ℃滅菌熱處理15 s,滅菌后在無(wú)菌條件下將樣品放入無(wú)菌帶蓋的無(wú)色透明玻璃試劑瓶中.
1.3.3 儲(chǔ)藏條件對(duì)甾醇穩(wěn)定性影響
制備得到含有植物甾醇的功能性飲料分別在以下條件下存放,每隔一個(gè)月取樣測(cè)定其甾醇和甾醇氧化物的質(zhì)量分?jǐn)?shù),研究不同存放條件下甾醇的穩(wěn)定性.儲(chǔ)藏溫度:三種不同基質(zhì)的含有甾醇的飲料分別放置在4, 20, 35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中.光照試驗(yàn):將三種不同基質(zhì)的含有甾醇的飲料分別在室溫(25 ℃左右)20 W白熾燈和避光條件保存.
1.3.4 內(nèi)標(biāo)液的制備
精確稱取50 mg 5α-膽甾烷,用色譜級(jí)正己烷溶解并定容于100 mL的容量瓶中,混勻,制備得到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)液.
1.3.5 固相萃取分離富集甾醇氧化物(POPs)
先用正己烷活化固相萃取小柱,將樣品溶解在體積比為9∶1的正己烷和乙醚的混合液中,隨后倒入萃取柱.在真空抽濾的條件下,加入體積比為9∶1的正己烷-乙醚混合液,用離心管收集,待溶液完全流下后,再加入體積比為1∶1的正己烷-乙醚混合液[8].加入7 mL丙酮洗脫除去氧化物,5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo),加入到洗脫液中.
將含有POPs的丙酮溶液用氮吹儀氮?dú)獯蹈刹⒓尤?00 μL無(wú)水吡啶和100 μL BSTFA(含1%的TMCS)混合溶液,在室溫下放置4 h后氮?dú)獯蹈?重新溶于色譜級(jí)正己烷待進(jìn)一步的分析.
1.3.6 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)定性分析飲料中POPs
由于POPs的標(biāo)準(zhǔn)品市面上無(wú)法購(gòu)得,但為了分析儲(chǔ)藏期間飲料中的POPs,在實(shí)驗(yàn)室模擬甾醇的氧化條件,將豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和24-亞甲基膽甾醇進(jìn)行熱氧化,GC-MS鑒定POPs,具體的氧化條件和GC-MS方法參考文獻(xiàn)[9].
氧化步驟:取10 mg植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品,在180 ℃烘箱中加熱氧化3 h,冷卻即得植物甾醇氧化物.
飲料中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GC-MS測(cè)定[10],測(cè)定條件如下:
1) 氣相色譜條件.毛細(xì)管柱:TG-5MS柱(30 m×0.25 mm,0.32 μm);升溫程序:起始溫度160 ℃,保持1 min,以40 ℃/min升至270 ℃,保持1 min,然后以4 ℃/min升至280 ℃,保持25 min.進(jìn)樣口溫度為300 ℃;載氣流速1.0 mL/min;分流比為20∶1.
2) 質(zhì)譜條件.電子轟擊離子源(EI),電子能量70 eV,離子源溫度200 ℃,接口溫度300 ℃,掃描質(zhì)量范圍100~650 Da.各組份經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及NIST 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索相匹配,確定POPs的組成成分.
1.3.7 定量分析飲料中POPs
飲料中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用內(nèi)標(biāo)法,以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo),7β-羥基豆甾醇氧化物為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.090 7x-0.001 6,x為標(biāo)樣濃度,y為標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,相關(guān)系數(shù)R2=0.994 3,POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)以7-羥基氧化物計(jì).
1.3.8 飲料中植物甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定
植物甾醇與硫酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生顏色,不同種類的植物甾醇只是C-17支鏈的結(jié)構(gòu)不同,發(fā)生反應(yīng)的顯色基團(tuán)相同,因此采用磷硫鐵顯色法[11]測(cè)總甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù).
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程為y=6.646 9x-0.010 7,其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8.
稱取一定量的樣品,用無(wú)水乙醇溶解后定容至容量瓶中.根據(jù)樣品數(shù)量不同,取不同數(shù)量的試管,分別加入樣品溶液、無(wú)水乙醇和磷硫鐵顯色劑各2 mL,使用漩渦振蕩儀使其均勻,15 min之后使用分光光度計(jì)在520 nm處測(cè)其吸光值,樣品總甾醇含量計(jì)算公式為
式中:m為樣品吸光度對(duì)應(yīng)的豆甾醇量,μg;V為定容體積,mL;B為稀釋倍數(shù);M為樣品重量,mg.
植物甾醇的損失率計(jì)算公式為
甾醇損失率=
1.3.9 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以origin 8.5軟件處理,以SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取其平均值.
2.1 GC-MS測(cè)定植物甾醇氧化后POPs的組成
植物甾醇的氧化主要是由于甾醇結(jié)構(gòu)上的烯丙基上的氫原子不穩(wěn)定,易丟失變成自由基,與氧分子形成7α-氫過(guò)氧化物和7β-氫過(guò)氧化物,這兩種化合物不穩(wěn)定生成7α-羥基化合物和7β-羥基化合物.7α-羥基化合物和7β-羥基化合物脫氫以及氫過(guò)氧化物脫水生成7-酮基化合物.六元環(huán)上的雙鍵也不穩(wěn)定,易與氧氣反應(yīng)生成環(huán)氧化物.
羥基化合物植物甾醇經(jīng)過(guò)熱氧化后生成POPs,將POPs硅烷化處理后進(jìn)行GC-MS分析鑒定,得到POPs的總離子流圖如圖1所示.由圖1可知:甾醇氧化后生成13種POPs,主要的POPs衍生物出峰時(shí)間如表1所示.
圖1 POPs的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS ion flow chromatogram of POPs
序號(hào)保留時(shí)間/minPOPs類型125.67β?epoxystigmasterol229.48α?epoxystigmasterol329.65β?epoxysitosterol432.51α?epoxysitosterol533.077?ketostigmasterol635.287?ketocampesterol735.727α?hydroxycampesterol836.857α?hydroxysitosterol937.717α?hydroxystigmasterol1038.267β?hydroxycampesterol1139.217β?hydroxystigmasterol1239.797β?hydroxysitosterol1340.927β?hydroxycholeserol
2.2 不同儲(chǔ)藏溫度下各飲料中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
2.2.1 牛奶中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
甾醇的氧化機(jī)制和不飽和脂肪酸氧化機(jī)制類似,即啟動(dòng)了一個(gè)自動(dòng)催化的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[12],其氧化降解機(jī)制遵循自由基氧化機(jī)制[13].POPs由于受到熱作用的影響,誘導(dǎo)形成自由基攻擊甾醇環(huán)結(jié)構(gòu)中的雙鍵而生成[14].
圖2 不同儲(chǔ)藏溫度下牛奶中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 Fig.2 Changes of POPs in milk at different storage temperatures
由圖2可知:在儲(chǔ)藏期間,隨著溫度的升高,POPs增加量更為顯著(P<0.05),儲(chǔ)藏結(jié)束后,存放在溫度為35 ℃條件下的牛奶中POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由(198.14±26.29) μg/g增加至(997.09±26.48)μg/g,放置在20 ℃條件下的牛奶中POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至(802.75±32.03) μg/g,4 ℃條件下的牛奶中POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至(415.22±11.91) μg/g.
2.2.2 果汁中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
由圖3可知:35 ℃儲(chǔ)藏條件下,果汁中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加明顯(P<0.05),由最初的(181.50±5.91)μg/g上升至(736.00±17.84) μg/g,20 ℃條件下果汁中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至(631.40±22.99)μg/g,4 ℃條件下的果汁中POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(346.98±13.64) μg/g.
圖3 不同儲(chǔ)藏溫度下果汁中POPs含量的變化 Fig.3 Changes of POPs in fruit juice at different storage temperatures
儲(chǔ)藏期結(jié)束后,果汁中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)于牛奶中的少,可能是由于果汁中的多酚具有抗氧化作用,抑制了植物甾醇發(fā)生氧化反應(yīng),也可能與牛奶的熱處理相關(guān),在早期的美拉德反應(yīng)過(guò)程中形成了氧分子,進(jìn)而誘導(dǎo)牛奶中的促氧化劑活性增加[15].
2.2.3 果汁乳飲料中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化
由圖4可知:在果汁乳飲料中,POPs增加量仍然與溫度存在顯著關(guān)系(P<0.05),即儲(chǔ)藏溫度越高,果汁乳飲料中POPs的增加量越多.當(dāng)溫度為35 ℃時(shí),儲(chǔ)藏期結(jié)束后果汁乳飲料中的POPs由(190.46±7.03) μg/g增加至(626.04±23.79) μg/g,儲(chǔ)藏溫度為20 ℃時(shí)POPs增加至(501.29±7.94) μg/g,儲(chǔ)藏溫度為4 ℃時(shí),POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至(237.65±16.48) μg/g.
圖4 不同儲(chǔ)藏溫度下果汁乳飲料中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 Fig.4 Changes of POPs in juice-milk beverage at different storage temperatures
但果汁乳飲料中POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)量較牛奶和果汁基質(zhì)中的少,這可能是由于果汁中的多酚類物質(zhì)與牛奶相互作用,維持了在熱加工處理過(guò)程中甾醇的抗氧化能力.
2.3 不同儲(chǔ)藏溫度對(duì)各飲料中植物甾醇損失率的影響
由表2可知:植物甾醇在各飲料中的損失率與儲(chǔ)藏溫度有關(guān),即溫度越高甾醇的損失率越高.儲(chǔ)藏期結(jié)束以后,4 ℃條件下保存的果汁乳飲料中的植物甾醇的損失率最低,而35 ℃條件下保存的牛奶中的植物甾醇的甾醇損失率最大.
表2 不同儲(chǔ)藏溫度各飲料中植物甾醇的損失率
續(xù)表2
2.4 光照對(duì)不同基質(zhì)飲料中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響
由圖5可以看出:在儲(chǔ)藏期內(nèi),光照和避光儲(chǔ)藏的飲料中POPs變化差異較大,儲(chǔ)藏期結(jié)束以后,光照組POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于避光儲(chǔ)藏組(P<0.05),由此可見,光照對(duì)于植物甾醇在飲料中的氧化程度有很大的影響,且避光儲(chǔ)藏時(shí)飲料中的POPs生成量明顯少于光照儲(chǔ)藏.因此,含甾醇的功能性飲料應(yīng)儲(chǔ)存在避光條件下,或者在選擇包裝材料時(shí)應(yīng)選擇不透光的容器.
圖5 光照對(duì)不同基質(zhì)飲料中POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 Fig.5 Effects of light on the content of POPs in different matrix
含有植物甾醇的三種不同基質(zhì)的飲料在不同的溫度下保存,每隔一個(gè)月測(cè)定飲料中植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù),并固相萃取純化POPs,利用GC-MS測(cè)定飲料中的POPs質(zhì)量分?jǐn)?shù).結(jié)果顯示:隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加,POPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)亦增加,植物甾醇的損失率增加,且低溫有利于保持植物甾醇的穩(wěn)定性,其中以果汁乳飲料為基質(zhì)的植物甾醇儲(chǔ)藏穩(wěn)定性最好,果汁次之,牛奶最差.光照試驗(yàn)結(jié)果顯示:避光保存能較好保持各飲料中植物甾醇的穩(wěn)定性,能夠在一定程度上抑制POPs的生成.因此,含有植物甾醇的功能性飲料應(yīng)在低溫下保存,以果汁乳飲料為基質(zhì),在選擇包裝材料時(shí)應(yīng)選擇避光的容器.本研究結(jié)果可為含有植物甾醇的功能性飲料的科學(xué)儲(chǔ)存提供指導(dǎo),同時(shí)也為今后功能性飲料的開發(fā)和應(yīng)用提供思路.
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(責(zé)任編輯:朱小惠)
Storage stability of phytosterol in beverages of different matrix
YANG Kai, WANG Leying, XU Mengting, SUN Peilong
(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)
Equivalent amount of emulsified phytosterols were added into the milk, fruit juice and juice-milk beverage. All the beverages were stored at 4, 20, 35 ℃ for three months and the content of phytosterol oxidation products (POPs) and phytosterol were determined at regular time every other month. The results showed that the contents of POPs in milk were the highest, followed by fruit juice and juice-milk beverage. The highest contents of POPs in the milk stored at 35 ℃ were (357.09±26.48) μg/g, the losses of total phytosterol were (25.50±1.03)% after three months, and the lowest contents of POPs in the juice-milk beverage stored at 35 ℃ were (237.65±16.48) μg/g and the losses of total phytosterol were (2.95±0.37)%. The three beverages of different matrix containing phytosterols were stored at room temperature under light and dark conditions, respectively and the contents of POPs in the light group were significantly higher than that in the dark group.
phytosterol; beverages; oxidation products; storage stability
2017-02-11
浙江省科技廳植物食品創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2012R10032-09)
楊 開(1978—),男,浙江奉化人,副研究員,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與資源利用,E-mail:yangkai@zjut.edu.cn.
TS201.2
A
1674-2214(2017)01-0006-05