張爽，晏磊，陳志寶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

硫氧化菌的地域分布特征

張爽，晏磊，陳志寶

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中硫氧化菌的現(xiàn)有16S rDNA序列分析，并構(gòu)建硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)而探討不同地域硫氧化菌分布特性。NCBI中共有硫氧化菌16S rDNA序列298條，經(jīng)相似性分析后發(fā)現(xiàn)共有53條不同的序列，分別源自溫泉湖、礦區(qū)、瀉湖等區(qū)域。全長(zhǎng)序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，全球硫氧化菌的分布具有一定的地域性，即溫泉湖與礦區(qū)、瀉湖的硫氧化菌差別明顯。不同地域硫氧化菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，鉛鋅礦區(qū)與銅礦區(qū)的硫氧化菌區(qū)分明顯；而同為溫泉湖或礦區(qū)、瀉湖生境中的硫氧化菌相似性極高，即相同生境中的硫氧化菌相似性較高，表明硫氧化菌的類型與生境條件有較大的關(guān)聯(lián)性?；趯?duì)硫氧化菌16S rDNA的序列分析，推測(cè)硫氧化菌的起源可能是多源的，生境條件作為重要的進(jìn)化壓力在硫氧化菌長(zhǎng)期演化過(guò)程中具有舉足輕重的作用。

硫氧化菌；16S rDNA序列分析；系統(tǒng)發(fā)育；地域分布

硫氧化菌（Sulfur oxidizing bacteria，SOB）是一類通過(guò)氧化還原性硫化物獲取能源生長(zhǎng)的特殊微生物，在pH 1.0～9.0的環(huán)境中均能生長(zhǎng)[1]。SOB在自然界的分布極為廣泛，從火山熔巖到礦山廢水[2]，從海洋底泥到鹽堿湖泊[3]，從陸地?zé)崛接筒佧u水[4-5]，從根際土壤到地表河流[6]，即使在金屬離子濃度極高的區(qū)域[7]，都分布了SOB的一些種類，是極端環(huán)境中占優(yōu)勢(shì)的古老微生物之一。由于SOB在硫的地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用，以及在生物浸礦和環(huán)境治理方面的應(yīng)用，使其成為當(dāng)前地球科學(xué)、環(huán)境科學(xué)以及生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前為止，從NCBI信息庫(kù)中搜索到的硫氧化菌序列共298條，但由于硫氧化菌在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)及氧的要求比較苛刻，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境難以重現(xiàn)其真實(shí)生存環(huán)境，因此獲得的純培養(yǎng)硫氧化菌種類較少。16S rDNA在結(jié)構(gòu)與功能上具有極高的保守性，因此常被用作原核生物系統(tǒng)發(fā)育以及多樣性研究的標(biāo)志性基因，用表型方法難以鑒定的細(xì)菌，用16S rDNA序列分析均能進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[8]。由于目前獲得的硫氧化菌純培養(yǎng)菌株種類較少，使得多數(shù)未純培養(yǎng)的硫氧化菌通過(guò)分析16S rDNA序列來(lái)確定它們的系統(tǒng)進(jìn)化位置。近年來(lái)，由于硫氧化菌在分子形態(tài)、生理活性以及系統(tǒng)發(fā)育等方面具有多樣性，硫氧化菌的生態(tài)學(xué)意義被廣泛關(guān)注。研究旨在通過(guò)對(duì)來(lái)自NCBI中298條不同地域和生境及相同地域和生境的硫氧化菌16S rDNA序列進(jìn)行的分析，及對(duì)溫泉湖、礦區(qū)、瀉湖等已發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，初步探討硫氧化菌的地域分布特征。

1 數(shù)據(jù)來(lái)源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

研究所使用的數(shù)據(jù)均來(lái)自截至2014年3月在NCBI信息庫(kù)中搜索，獲得硫氧化菌298條16S rDNA。搜索關(guān)鍵詞包括Sulfobacillus acidophilus，Sulfobacillus thermotolerans，Sulfolobus tokodaii等，盡可能涵蓋所有硫氧化菌16S rDNA序列，并對(duì)獲得的硫氧化菌16S rDNA序列進(jìn)行必要的篩選，刪除非硫氧化菌的16S rDNA序列。

1.2 數(shù)據(jù)整理與分析方法

將篩選后的硫氧化菌 16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov／blast），每條序列即可獲得與其相似性最高的序列，再利用clustal1.83軟件對(duì)得到的硫氧化菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性分析。Stackebrandt等[9]認(rèn)為，當(dāng)16S rDNA相似性高于97%以上時(shí)，即可判定為同屬于一個(gè)種。如若同一個(gè)地點(diǎn)、同一次提交的序列中有2條序列的相似性均高于97%，即可判定兩者為同一種硫氧化菌的序列，則保留其中一個(gè)序列即可。將所有序列逐一整理，按生境（火山熔巖、礦山廢水、海洋底泥、鹽堿湖泊、陸地?zé)崛?、油藏鹵水、根際土壤、地表河流湖泊和礦區(qū)等）、分類地位、發(fā)現(xiàn)地域和所屬國(guó)家、以及序列長(zhǎng)度等方面進(jìn)行歸類并逐一統(tǒng)計(jì)。

由于所提交的16S rDNA序列存在長(zhǎng)度不等問(wèn)題，無(wú)法直接構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。因此，研究利用硫氧化菌16S rDNA序列的前段（約750 bp）、中段（約600 bp）及后段（約750 bp）分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，并從中挑選全長(zhǎng)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。充分應(yīng)用MEGA5.0軟件利用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而實(shí)現(xiàn)硫氧化菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析。同時(shí)，對(duì)不同生境（湖泊和礦區(qū)火山熔巖、礦山廢水、海洋底泥、鹽堿湖泊、陸地?zé)崛⒂筒佧u水、根際土壤、地表河流湖泊和礦區(qū)等）的硫氧化菌進(jìn)行分析，對(duì)不同地域的硫氧化菌進(jìn)行分析，探索其規(guī)律性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)整理

從NCBI信息庫(kù)中共搜索到硫氧化菌16S rDNA序列298條，其中包括湖泊硫氧化菌序列185條，礦區(qū)硫氧化菌序列115條。利用clustal1.83軟件對(duì)獲得的硫氧化菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性分析，若相似性高于97%即判定為屬于同一序列[9]；若有2條序列相似性均高于97%，則保留其中一個(gè)序列即可。刪除重復(fù)序列后所獲得的湖泊、礦區(qū)硫氧化菌序列分別為36條、17條，共計(jì)53條，見(jiàn)表1。

表1 硫氧化菌種數(shù)統(tǒng)計(jì)（據(jù)提交NCBI的16S rDNA序列數(shù)統(tǒng)計(jì)）Table 1 Sulfur oxidizing bacteria statistics（according to the 16S rDNA submitted to the NCBI）

在獲得的53條不同硫氧化菌序列中，γ-變形菌綱序列15條，熱變形菌綱序列14條，綠菌綱序列13條，綠彎菌綱和β-變形菌綱的硫氧化菌序列較少。

研究發(fā)現(xiàn)，硫氧化菌的發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)主要集中在中國(guó)、印度、智利、伊朗等。各地發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌均以熱變形菌綱居多，而中國(guó)發(fā)現(xiàn)的以梭狀芽孢桿菌綱居多。

2.2 硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究篩選后的16S rDNA序列共53條，因獲得的16S rDNA序列長(zhǎng)度不等，無(wú)法直接構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。故分別選取硫氧化菌16S rDNA序列的前段（約750 bp）、中段（約600 bp）及后段（約750 bp），構(gòu)建較為精確的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行比較分析（圖1）。從系統(tǒng)進(jìn)化樹中不難發(fā)現(xiàn)湖泊（溫泉湖、瀉湖）硫氧化菌與礦區(qū)硫氧化菌聚類分區(qū)明顯，各自分區(qū)聚類在一起，但是由于所屬綱不同，硫氧化菌的分布有所不同。

2.3 不同區(qū)域的硫氧化菌比較

2.3.1 湖泊與礦區(qū)硫氧化菌比較

湖泊與礦區(qū)硫氧化菌的比較（見(jiàn)圖1），由圖1可見(jiàn)，湖泊中以熱變形菌綱和綠菌綱硫氧化菌為主，約為75.0%；而礦區(qū)中的硫氧化菌以γ-變形菌綱為主，約為88.2%。同時(shí)，由圖1的進(jìn)化樹也可以發(fā)現(xiàn)，湖泊與礦區(qū)硫氧化菌相似程度較低，表明系統(tǒng)進(jìn)化位置具有明顯差別。

圖1 湖泊與礦區(qū)中硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in lake and mine

2.3.2 溫泉湖與瀉湖硫氧化菌比較

溫泉湖（中國(guó)廈門海）與瀉湖中硫氧化菌的比較（見(jiàn)圖2），由圖2可見(jiàn)，瀉湖中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌以綠菌綱為主，相較于溫泉湖中發(fā)現(xiàn)的熱變形菌綱和梭狀芽孢綱，其同源性約為78%，表明溫泉湖中的硫氧化菌與瀉湖中的硫氧化菌相似程度較低。溫泉湖中的硫氧化菌具有嗜熱嗜酸的特性，而瀉湖中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌通常能夠耐受較高濃度，推測(cè)溫泉湖與瀉湖硫氧化菌區(qū)分明顯可能是其自身特性不同產(chǎn)生的結(jié)果。

圖2 溫泉湖與瀉湖中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in hot spring and lagoon

2.3.3 不同地域礦區(qū)硫氧化菌比較

不同地域礦區(qū)硫氧化菌的比較，僅針對(duì)中國(guó)與智利、秘魯?shù)V區(qū)生境硫氧化菌進(jìn)行比較（見(jiàn)圖3），由圖3可見(jiàn)，在智利與秘魯?shù)V區(qū)中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌屬于梭狀芽孢桿菌綱，而中國(guó)礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌多屬于γ-變形菌綱。因不同地域礦區(qū)硫氧化菌所屬分類地位不同，使得硫氧化菌的相似性極低，各自形成獨(dú)立分支。伴隨著研究的不斷深入，不同地域硫氧化菌的多樣性特性將不斷明晰。

圖3 中國(guó)與智利發(fā)現(xiàn)的礦區(qū)中硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of SOB in mine from China and Chile

3 討論

通過(guò)對(duì)不同地域硫氧化菌系統(tǒng)進(jìn)化的分析，不難發(fā)現(xiàn)相近生境的硫氧化菌相似性較高。此外，目前發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌多存在于湖泊，并以溫泉湖為主，且多為溫泉湖出口。由此推測(cè)硫氧化菌的分布可能具有區(qū)域性特征，其在世界各地的生境中可能以“土著”的方式存在。為了適應(yīng)生境，不同地域類型硫氧化菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化被逐漸形成。

對(duì)比礦區(qū)與湖泊硫氧化菌，不難發(fā)現(xiàn)溫泉湖硫氧化菌16S rDNA序列大多聚集在一起，與礦區(qū)或?yàn)a湖中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌形成明顯分支差異。存在于相似生境的硫氧化菌相似性程度較高，究其原因可能是由于相似生境具有相似條件（如溫度、酸度、鹽度及其他種類元素等），而生境又是推動(dòng)硫氧化菌進(jìn)化的主動(dòng)力，因此促使硫氧化菌向同一方向進(jìn)化，最終形成相似性較高的硫氧化菌。反之，不同生境的硫氧菌經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化形成不同類型的硫氧化菌。

縱使相似生境中發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌相似性較高，但也存在特例。研究發(fā)現(xiàn)礦石浸出物中的硫氧化菌（EF101930.1）與在溫泉湖發(fā)現(xiàn)的硫氧化菌（EU419196.1），經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)兩者相似性高達(dá)92%。換言之，在不同地域生境中發(fā)現(xiàn)了2株16S rDNA序列比較接近的硫氧化菌?？赡苁怯捎谠惊?dú)立存在的硫氧化菌在進(jìn)化過(guò)程中被趨同進(jìn)化，進(jìn)而形成相似性極高的硫氧化菌類型。這2株相似性極高的硫氧化菌可能是進(jìn)化過(guò)程的偶然現(xiàn)象，也有可能是生境被作為進(jìn)化壓力的某些環(huán)境因子（如溫度、酸度、鹽度及其他種類元素等）發(fā)揮了作用，導(dǎo)致硫氧化菌朝同一方向進(jìn)化。僅通過(guò)數(shù)據(jù)分析并不能完全認(rèn)定這2株相似性較高的硫氧化菌為功能相同的一類原核微生物。據(jù)張文燕等[8，10]報(bào)道，引起痢疾的病原菌與普通大腸桿菌的16S rDNA相似性高于97%，系統(tǒng)進(jìn)化分析認(rèn)為二者屬于同一類細(xì)菌，但實(shí)則二者生理功能不同，且功能迥異。因此，鑒于具有特定功能的一類原核微生物而言，如硫氧化菌，功能基因或全基因組的分類分析較16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹意義更為深遠(yuǎn)。

研究受NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)硫氧化菌16S rDNA序列數(shù)量的限制，故有些分析結(jié)果還需更深入的研究來(lái)證實(shí)。伴隨著硫氧化菌研究的不斷深入及微生物分離及培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，更多、更純的硫氧化菌將被獲得。同時(shí)，隨著種類繁多、數(shù)量龐大的硫氧化菌的不斷發(fā)現(xiàn)，輔以分子和基因水平的深入研究，必將獲得不同地域有關(guān)于硫氧化菌更多、更全的生態(tài)信息，為更深入的認(rèn)識(shí)和理解硫氧化菌生境意義和應(yīng)用前景打下更為殷實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析硫氧化菌16S rDNA序列，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)處于不同地域的硫氧化菌具有明顯的地域分布特性，如湖泊（溫泉湖、瀉湖）與礦區(qū)之間的硫氧化菌區(qū)分明顯。而處于相同生境的硫氧化菌，如同處于湖泊（溫泉湖、瀉湖）或礦區(qū)，則相似性極高，充分說(shuō)明硫氧化菌類型與生境之間具有密切聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)均驗(yàn)證生境作為進(jìn)化壓力在硫氧化菌長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中決定其向同一方向進(jìn)化（相似環(huán)生境形成相似硫氧化菌類型）或多元化方向進(jìn)化（不同生境形成不同硫氧化菌類型），由此推測(cè)硫氧化菌的起源可能是多源的。

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Geographical Distribution of Sulfur-oxidizing Bacteria

Zhang Shuang，Yan Lei，Chen Zhibao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Sulfur-oxidizing bacteria（SOB）were widely distributed in aquatic environments.To investigate the correlation between their evolutionary relatedness and geographical distribution，298 16S rDNA sequence available in the NCBI were analyzed，and phylogenic trees based on the sequences were constructed.Total 53 16S rDNA sequences of SOB were analyzed in detail，which derived from hot spring，mine and lagoon.Phylogeny analysis based on those sequences suggested that the geographical distribution of SOB had certain regional distribution character：SOB was different from hot spring，mine and lagoon.Regional analysis based on phylogenic analysis also suggested that the difference from lead-zinc mine and copper mine.In contrast，the SOB from similar habitats were closely related，such as hot spring，mine and lagoon.It was found that similar species had a large regional distribution and tried to adopt the similar habitats，morphotypes of SOB and their living conditions had a significant relevance.The observation suggested that SOB might have multiple evolutionary origins.And it also suggested that the environmental conditions，as an important evolutionary pressure，played an important role in the long-term evolution of SOB.

Sulfur oxidizing bacteria（SOB）；16S rDNA sequence analysis；phylogeny analysis；geographical distribution

Q938

A

1002-2090（2017）02-0068-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.014

2016-03-29

張爽（1981-），女，講師，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事微生物藥物分析方面的教學(xué)與研究工作。