蔡小東，曹文娟

（長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

冰糖橙葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間氧化脅迫的比較分析

蔡小東，曹文娟

（長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025）

通過測定原生質(zhì)體分離過程中超氧陰離子自由基（）產(chǎn)生速率、丙二醛含量、超氧物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、還原型谷胱甘肽含量以及抗壞血酸含量的變化，以探討柑橘不同來源原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制。結(jié)果表明，在原生質(zhì)體分離過程中，不能再生的冰糖橙葉片原生質(zhì)體產(chǎn)生速率和MDA積累量在同一酶解時間均較愈傷組織高；愈傷組織原生質(zhì)體酶解過程中SOD活性的變化趨勢與產(chǎn)生速率趨勢基本一致，即逐漸增加，而葉片原生質(zhì)體在酶解12 h后SOD活性顯著下降；在酶解后的同一時間點(diǎn)，愈傷組織原生質(zhì)體CAT活性總是顯著高于葉片原生質(zhì)體，愈傷組織原生質(zhì)體GSH 和AsA含量也總是高于葉片。柑橘不同來源原生質(zhì)體再生能力存在差異，其原因可能與原生質(zhì)體分離過程中活性氧（AOS）、保護(hù)酶和抗氧化物質(zhì)的代謝平衡有關(guān)，即與AOS產(chǎn)生與清除之間的平衡有關(guān)。

柑橘；原生質(zhì)體；氧化脅迫；保護(hù)酶；抗氧化物質(zhì)

植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁后由質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞，在適宜培養(yǎng)體系下具有再生完整植株的潛能。目前，隨著原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的不斷完善和改進(jìn)，原生質(zhì)體再生成株的植物種類越來越多［1-2］。然而，某些植物種類原生質(zhì)體再生困難，即使同一基因型植物的細(xì)胞、組織或器官分離的原生質(zhì)體再生能力也存在差異［3］。在柑橘中，多年來原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)研究中普遍存在這種現(xiàn)象，即胚性愈傷組織和葉肉來源原生質(zhì)體具有不同的再生能力。柑橘胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)已在多個種、屬上獲得成功，然而葉肉原生質(zhì)體無論單獨(dú)培養(yǎng)還是共培養(yǎng)均沒有持續(xù)分裂能力［4-6］。因此柑橘不同來源原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制有待深入研究。

細(xì)胞壁降解酶是一種逆境誘導(dǎo)劑。研究表明，植物原生質(zhì)體在分離或培養(yǎng)過程中會遭遇復(fù)雜的代謝變化，產(chǎn)生較高水平的活性氧（Active oxygen species，AOS），從而引起氧化脅迫［7-12］。高水平的AOS能直接或間接啟動膜脂的過氧化作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷和破壞。細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的主要場所，細(xì)胞膜的損傷和破壞會引起細(xì)胞代謝紊亂，氧化脅迫可能降低原生質(zhì)體的再生能力，甚至引起原生質(zhì)體頑拗現(xiàn)象的發(fā)生［8-9］。在原生質(zhì)體分離過程中，王麗莉等［7］發(fā)現(xiàn)小麥葉肉原生質(zhì)體膜受到的傷害對隨后的培養(yǎng)過程產(chǎn)生不良影響，膜損傷的發(fā)生可能與原生質(zhì)體能否進(jìn)入正常分裂狀態(tài)有關(guān)。同時，植物細(xì)胞本身具有防止氧化脅迫早期形成的胞內(nèi)酶促防御系統(tǒng)（即保護(hù)酶系統(tǒng)）和抗氧化物質(zhì)防御系統(tǒng)，細(xì)胞中AOS水平主要由產(chǎn)生和清除之間的平衡所決定。煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成功率通常較甘蔗高，其原因可能是由于煙草原生質(zhì)體總的清除自由基的能力比甘蔗強(qiáng)［12］。

研究柑橘等植物不同來源原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制，對利用原生質(zhì)體再生體系進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良具有重要意義。本研究以冰糖橙試管苗和愈傷組織為材料，對葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間的氧化脅迫進(jìn)行分析，以期在原生質(zhì)體分離階段揭示不同來源柑橘原生質(zhì)體再生能力差異的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冰糖橙（Citrus Sinensis L. Osbeck cv. Bingtang）胚性愈傷組織從成熟果實(shí)未發(fā)育胚珠誘導(dǎo)［13］，現(xiàn)保存于長江大學(xué)園藝植物逆境生理實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)室中。胚性愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)3代后用于原生質(zhì)體分離。冰糖橙成熟種子先用1% NaOH浸泡5～10 min，期間用玻璃棒攪拌以除去種子表面果膠；洗凈NaOH后，經(jīng)0.1% HgCl表面消毒10 min，無菌水清洗5次，去種皮，接種于MT基本培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖和7.5 g瓊脂，pH 5.8），接種后20～30 d左右取充分展開的葉片分離原生質(zhì)體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體的分離 原生質(zhì)體的分離參照Grosser等［14］的方法進(jìn)行，略有改進(jìn)。（1）愈傷組織原生質(zhì)體的分離：用吸管吸取1 g左右繼代6～10 d的冰糖橙懸浮愈傷組織于高溫高壓滅菌的15 mm×60 mm培養(yǎng)皿中，吸干培養(yǎng)基后加入1.8 mL 0.7 EME（MT+0.7 mol/L蔗糖+1 500 mg/L ME）、1.8 mL 酶混合液（0.6%纖維素酶R-10+0.6% 離析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaCl2·2H2O，調(diào)節(jié)pH為 5.8，酶液通過0.22 μm醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌），輕輕搖勻后用封口膜封口，在生化培養(yǎng)箱中25℃暗條件下靜置酶解。

（2）葉肉原生質(zhì)體的分離：用鑷子取出冰糖橙無菌苗放置在高溫高壓滅菌的濾紙上，剪下葉片，將葉片切成條狀，寬度為0.5～1.0 mm。再放入預(yù)先加入1.5 mL 0.6 EME（MT+0.6 mol/L蔗糖+1 500 mg/L ME）15 mm×60 mm培養(yǎng)皿中，之后加入1.8 mL上述酶混合液，搖勻后用封口膜封口，在生化培養(yǎng)箱中25℃暗條件下靜置酶解。

1.2.2 酶解過程中樣品制備 柑橘原生質(zhì)體一般酶解時間為15～18 h。本研究中樣品分別在酶解6、12、18 h取樣。樣品先經(jīng)過孔徑為45 μm不銹鋼濾網(wǎng)過濾，以除去未酶解完全的材料及大細(xì)胞團(tuán)，并用CPW13洗滌過濾，濾液在700 r/min離心10 min，使原生質(zhì)體（含未去壁細(xì)胞）沉于管底。之后加入1 mL 0.1 M磷酸緩沖液磷酸緩沖液（pH7.8），在4℃、4 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀物液氮凍存，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MDA含量、保護(hù)酶活性、抗氧化物質(zhì)含量的測定 MDA含量、SOD活性、CAT活性、POD活性、GSH含量以及AsA含量的測定分別參照南京建成生物工程公司提供的測試盒說明書進(jìn)行。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，LSD法作多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間產(chǎn)生速率的變化

從圖1可以看出，冰糖橙愈傷組織和葉片在酶解過程中，隨著酶解時間的延長，產(chǎn)生速率均呈上升趨勢。其中葉片酶解過程中產(chǎn)生速率急劇增加，酶解18 h原生質(zhì)體樣品產(chǎn)生速率達(dá)到1.19 nmol/min·g（FW），顯著高于酶解12 h和6 h的產(chǎn)生速率（0.72、0.63 nmol/min·g，F(xiàn)W）。而愈傷組織原生質(zhì)體在酶解過程中產(chǎn)生速率也一直在增加，但酶解12 h后增加不顯著。此外，在酶解后的3個時間點(diǎn)分別比較葉片和愈傷組織生質(zhì)體產(chǎn)生速率，結(jié)果顯示葉片原生質(zhì)體產(chǎn)生速率均顯著高于同時期愈傷組織原生質(zhì)體。

圖1 冰糖橙愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離期間產(chǎn)生速率的變化

2.2 葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間MDA含量的變化

冰糖橙葉片和愈傷組織酶解分離期間，作為膜脂過氧化程度的指標(biāo)之一的MDA含量變化如圖2所示。由圖2可知，愈傷組織酶解過程中，MDA含量呈先升高后下降的趨勢，其中酶解6～12 h MDA含量顯著升高，酶解12～18 h MDA含量顯著下降，但酶解處理18 h與6 h的樣品MDA含量差異不顯著；而葉片MDA含量酶解6～12 h有所下降，但下降幅度并不顯著，之后MDA含量顯著上升，酶解18 h達(dá)到最大值。與愈傷組織相比，葉片在酶解過程中MDA積累量更大，葉片原生質(zhì)體的MDA含量酶解18 h為愈傷組織的2.13倍。這說明在原生質(zhì)體分離后期，葉片原生質(zhì)體膜脂過氧化程度更高。

圖2 冰糖橙愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離期間MDA含量的變化

2.3 葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間保護(hù)酶活性的變化

從圖3A可以看出，冰糖橙葉片和愈傷組織原生質(zhì)體酶解初期，即酶解6～12 h，原生質(zhì)體樣品中SOD的活性均逐漸增強(qiáng)，但增加均不顯著；酶解12 h后，愈傷組織原生質(zhì)體樣品中SOD活性顯著上升，酶解18 h SOD活性達(dá)到734.28 U/g（FW）。然而，在此階段葉片原生質(zhì)體樣品中SOD的活性卻出現(xiàn)顯著下降，酶解18 h，葉片原生質(zhì)體樣品中SOD的活性降至413.06 U/g，F(xiàn)W，約為同時期愈傷組織原生質(zhì)體樣品的56.3%。愈傷組織和葉片酶解過程中POD活性的變化趨勢如圖3B所示。在原生質(zhì)體分離期間，冰糖橙愈傷組織和葉片原生質(zhì)體樣品中POD活性的變化趨勢基本一致，即POD活性在酶解初期上升，而在酶解12 h后表現(xiàn)下降趨勢；在酶解后的同一時間點(diǎn)，愈傷組織原生質(zhì)體樣品中CAT活性與葉片原生質(zhì)體樣品沒有顯著差異。由圖3C可知，冰糖橙葉片和愈傷組織原生質(zhì)體酶解過程中，CAT活性雖然都有一定程度的波動，但變化均不顯著。但是，在酶解后的同一時間點(diǎn)，愈傷組織原生質(zhì)體樣品中CAT活性總是顯著高于葉片原生質(zhì)體樣品。

圖3 冰糖橙和愈傷組織葉肉原生質(zhì)體分離期SOD（A）、POD（B）、CAT（C）活性的變化

2.4 葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間抗氧化物質(zhì)含量的變化

GSH含量的變化如圖4A所示，2種材料中GSH含量在原生質(zhì)體分離過程中變化趨勢不同。其中愈傷組織原生質(zhì)體樣品中GSH的含量隨酶解時間延長表現(xiàn)一直緩慢降低的趨勢，而葉片原生質(zhì)體樣品中GSH的含量在酶解初期顯著升高，之后又顯著下降。盡管如此，在酶解后的同一時間點(diǎn)，愈傷組織原生質(zhì)體樣品中GSH的含量總是高于葉片，尤其是在酶解6 h和18 h，LSD分析結(jié)果表明愈傷組織原生質(zhì)體樣品中GSH的含量顯著高于葉片。

愈傷組織和葉片酶解過程中AsA含量的變化如圖4B所示，在酶解6～12 h，二者AsA含量呈現(xiàn)增加趨勢，其中愈傷組織原生質(zhì)體樣品AsA含量顯著上升，酶解12 h時AsA含量最高。酶解12 h后，愈傷組織原生質(zhì)體樣品AsA含量顯著下降，而葉片原生質(zhì)體樣品AsA含量緩慢增加。在酶解后的同一時間點(diǎn)，愈傷組織原生質(zhì)體樣品中AsA的含量同GSH含量一樣，總是高于葉片。

圖4 冰糖橙愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離期間抗氧化物質(zhì)GSH（A）、AsA（B）含量的變化

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，在高濃度的AOS如超氧化自由基、羥基自由基、過氧化氫會氧化損傷脂質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等生物分子，破壞細(xì)胞的新陳代謝，導(dǎo)致原生質(zhì)體再生能力下降［8-10，12］。研究原生質(zhì)體酶解過程中AOS、保護(hù)酶和抗氧化物質(zhì)的動態(tài)變化，可以進(jìn)一步探討原生質(zhì)體分離過程中傷害的發(fā)生原理，從而為研究原生質(zhì)體再生能力差異的機(jī)制提供理論依據(jù)。

細(xì)胞中AOS水平主要由產(chǎn)生和清除之間的平衡所決定，SOD、POD和CAT是植物細(xì)胞內(nèi)清除活性氧和維持植物體內(nèi)活性氧平衡的重要抗氧化酶，并且一些抗氧化物質(zhì)（如GSH、AsA等）在植物體清除活性氧中也發(fā)揮了重要作用［8，10］。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要抗氧化酶，對清除活性氧有重要作用。本研究結(jié)果表明，冰糖橙愈傷組織原生質(zhì)體分離過程中中SOD活性的變化趨勢與產(chǎn)生速率趨勢較一致，而葉片原生質(zhì)體樣品中SOD的活性的變化趨勢與產(chǎn)生速率趨勢不一致。葉片酶解12 h后SOD活性持續(xù)下降清除能力減弱，這可以解釋為什么葉片原生質(zhì)體樣品中產(chǎn)生速率在酶解后期急劇上升。POD和CAT可以清除H2O2，減輕細(xì)胞氧化損傷。在酶解后的同一時間點(diǎn)，雖然愈傷組織原生質(zhì)體中POD活性與葉片原生質(zhì)體沒有顯著差異，但前者CAT活性總是顯著高于后者，并且愈傷組織原生質(zhì)體樣品中GSH和AsA含量總是高于葉片。這說明冰糖橙愈傷組織和葉片原生質(zhì)體再生能力的差異可能與分離過程中的保護(hù)酶活性和抗氧化物質(zhì)含量有關(guān)，低活性的保護(hù)酶活性可能引起了膜脂損傷，影響了原生質(zhì)體的再生能力。

細(xì)胞內(nèi)外AOS水平受許多內(nèi)源因素和外源因素的控制。植物細(xì)胞擁有復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，包括各種保護(hù)酶以及大量的非酶清除劑［16］。研究表明，原生質(zhì)體分離過程中的氧化脅迫對隨后的培養(yǎng)過程會產(chǎn)生不良影響，影響原生質(zhì)體的再生能力［8-10，12］。柑橘胚性愈傷組織原生質(zhì)體能夠再生，而葉肉原生質(zhì)體沒有持續(xù)分裂能力，其原因可能與原生質(zhì)體分離過程中的原生質(zhì)體酶解過程中AOS含量、保護(hù)酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的動態(tài)變化有關(guān)，即與AOS產(chǎn)生與清除之間的平衡有關(guān)。高水平的AOS對細(xì)胞膜的損傷以及如何抑制冰糖橙葉肉原生質(zhì)體分裂等問題還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 鄒移光）

Comparative analysis of oxidative stress between leaf and callus of Citrus Sinensis L.Osbeck cv. Bingtang during protoplasts isolation

CAI Xiao-dong，CAO Wen-juan
（College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou 434025，China）

To identify the mechanisms that citrus protoplasts from different origins hold different regeneration capacity，production rate，content of malonaldehyde（ MDA），glutathione（ GSH） ，ascorbic acid（ AsA），and activity of superoxide dismutase（ SOD），catalase（ CAT） and peroxidase（ POD） were analyzed during the maceration period. Results showed that both theproduction rate and MDA content of recalcitrant leaf mesophyllderived protoplasts were higher than those of callus protoplast at the same time of protoplast isolation. The change trend of SOD activity of callus protoplasts was similar to that ofproduction rate，i.e.，an increasing trend during the maceration period. However，the SOD activity of leaf protoplasts decreased significantly after 12 h of protoplast isolation. At the same time after protoplast isolation，the CAT activity of callus protoplasts was significantly higher than that of leaf protoplasts，and the contents of GSH and AsA of callus protoplasts was also higher than those of leaf protoplasts. Therefore，citrus protoplasts derived from different tissues had different regeneration capacity，could be due to the metabolic balance of active oxygen species（ AOS），protective enzyme and antioxidants，i.e.，AOS-generation and defense systems in cells.

Citrus；protoplast；oxidative stress；protective enzyme；antioxidants

S666.4

A

1004-874X（2017）02-0049-06

2016-12-11

長江大學(xué)引進(jìn)人才啟動項(xiàng)目（801190010101）

蔡小東（1978-）， 男，博士，副教授，E-mail：caixiao.dong@163.com

蔡小東，曹文娟.冰糖橙葉肉和愈傷組織原生質(zhì)體分離期間氧化脅迫的比較分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：49-54.