池福敏 水雨航 江帆 劉柳 辜雪冬 +羅章

摘要：采用堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白，制備抗氧化活性肽，以水解度和超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除率為指標，通過單因素試驗和正交試驗確定最佳酶解參數(shù)，并對酶解多肽的體外抗氧化活性進行測定。結果表明：堿性蛋白酶酶解的最適條件為底物質量分數(shù)2%、酶解時間5 h、酶添加量7 000 U/g；在最適條件下，堿性蛋白酶酶解所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]、DPPH自由基、羥基自由基（·OH）清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%；還原力、抗脂質過氧化能力分別為0.87、82.83%。

關鍵詞：藏雞蛋；卵白蛋白；多肽；抗氧化活性；堿性蛋白酶

中圖分類號： TS253.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0144-04

收稿日期：2016-08-03

基金項目：西藏自治區(qū)自然科學基金（編號：2015ZR-14-30）；國家自然科學基金地區(qū)科學基金（編號：31560492）。

作者簡介：池福敏（1985—），女，碩士研究生，講師，主要從事高原特色食品加工研究。E-mail：chifumin2008@163.com。

藏雞生活在我國青藏高原海拔2 200～4 100 m的半農(nóng)半牧區(qū)、雅魯藏布江中游流域河谷區(qū)、藏東三江中游高山峽谷區(qū)等區(qū)域，其生活環(huán)境相對封閉，幾乎無污染，因此藏雞蛋具有天然綠色的優(yōu)勢。巴桑等、陳烽烽等研究表明，藏雞蛋中粗蛋白質、粗脂肪、鐵、鋅、鈣的含量均高于普通雞蛋，具有比普通雞蛋更高的營養(yǎng)價值[1-2]。藏雞蛋具有綠色天然、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，開發(fā)利用前景廣闊。

卵白蛋白是雞蛋蛋清中一種重要的蛋白質，占蛋清中蛋白質的50%以上，含人體必需的8種氨基酸，是獲得抗氧化肽、抗菌肽、免疫肽、降血壓肽等生物活性肽的良好資源[3-6]。其中，抗氧化肽不僅具有多肽產(chǎn)品的營養(yǎng)作用，還具有抗氧化和清除體內自由基的功能，可增強人體抗衰老、抗疾病的能力[7-8]。

目前，國內外已有關于卵白蛋白抗氧化肽的研究報道。Davalos等研究發(fā)現(xiàn)，采用胃蛋白酶水解卵白蛋白可得到4種抗氧化肽，且4種肽的序列均包含在卵白蛋白序列中[9]。徐明生系統(tǒng)研究了卵白蛋白的提取和酶解制備抗氧化肽的工藝條件，并首次采用多種抗氧化活性試驗，全面研究了雞蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性[10]。沈勇根等用胃蛋白酶水解卵白蛋白，采用超濾、離子色譜、反相高效液相色譜法從卵白蛋白酶解液中分離制備抗氧化肽，得到抗氧化力較強的3個肽[11]。Chen等研究了不同酶酶解雞蛋清獲得水解物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶的酶解物具有最強的DPPH自由基清除力[12]。薛海燕等采用胃蛋白酶水解卵清蛋白，通過單因素和正交試驗確定了酶解的最佳條件[13]。然而目前，有關藏雞蛋卵白蛋白抗氧化肽的研究尚未見報道。本試驗以藏雞蛋卵白蛋白為材料，采用堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白制備抗氧化肽，探討最佳的水解條件，同時對其抗氧化活性進行測定，以期為以藏雞蛋卵白蛋白為原料的抗氧化肽及其他生物活性肽的進一步研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

藏雞蛋購自西藏自治區(qū)林芝市農(nóng)貿(mào)市場；堿性蛋白酶（活力單位≥10 000 U/g）、Trolox、考馬斯亮藍G-250、DPPH均購自Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷購自Amresco公司；大豆卵磷脂（BR）購自科密歐化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

AL104型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，UPH-II-10L型實驗室超純水機（成都優(yōu)越科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），R134a型冷凍離心機（德國艾本德股份公司），KPN型凱氏定氮儀（浙江托普儀器有限公司），JK-500DB型數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司），ZD-F12型冷凍干燥機（鄭州比朗儀器有限公司），UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]，99-1型大功率磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）。

1.3方法

1.3.1卵白蛋白的制備

按照傅冰等的方法[14]從藏雞蛋中提取卵白蛋白，制成藏雞蛋卵白蛋白凍干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2堿性蛋白酶酶解試驗設計

參照秦婧的前處理方法[15]，主要對堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白時的底物質量分數(shù)、水解時間、酶的添加量進行單因素試驗和正交試驗，通過測定酶解液的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度來判斷各因素對酶解效果的影響。

單因素試驗中各因素的具體情況如下。底物質量分數(shù)：分別設定底物質量分數(shù)為2%、3%、4%、5%、6%，在酶解時間為4 h、加酶量為8 000 U/g的條件下進行酶解。酶解時間：分別設定水解時間為2、3、4、5、6 h，在底物質量分數(shù)為3%、加酶量為8 000 U/g的條件下進行酶解。酶的添加量：分別設定酶的添加量為6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 U/g，在底物質量分數(shù)為3%、時間為4 h的條件下進行酶解。

在單因素試驗結果的基礎上，對3個因素進行L9（34）正交設計試驗（表1），確定最佳酶解參數(shù)。

1.3.3檢測指標

O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]進行測定。水解度的計算公式為：水解度=[SX（]氨基態(tài)氮總氮[SX）]×100%。采用甲醛滴定法[10]進行氨基態(tài)氮測定，采用凱氏定氮法[17]進行總氮測定。

1.3.4最優(yōu)組合驗證

對“1.3.2”節(jié)正交試驗中最優(yōu)組合得到的產(chǎn)物進行驗證，檢測指標包括O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除力、還原力、抗脂質過氧化能力。其中，O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]進行測定，DPPH自由基清除率、抗脂質過氧化能力采用秦婧的方法[15]進行測定，·OH清除力采用楊紅澎等的方法[18]進行測定，還原力采用許效群等的方法[19]進行測定。

2結果與分析

2.1堿性蛋白酶水解單因素試驗結果

2.1.1底物質量分數(shù)對酶解效果的影響

由圖1可知，隨著底物質量分數(shù)的增加，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率先逐漸上升，在3%時達到最大值后下降，此后又逐漸上升，整體呈現(xiàn)不規(guī)則的形式。隨著底物質量分數(shù)的增加，酶解產(chǎn)物的水解度則呈先增加、后減小的趨勢，當?shù)孜镔|量分數(shù)為3%時水解度最大。綜合兩者進行分析，3%為最佳的底物質量分數(shù)，此時O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為50.35%，水解度為59.64%。

[TPCFM1.tif][FK）]

2.1.2酶解時間對酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率逐漸增加，在4 h達到最大值后下降，但在6%時再次上升。酶解產(chǎn)物的水解度隨著酶解時間的延長逐漸上升，在4 h后上升趨勢平緩。綜合兩者[CM（25]進行分析，確定4[KG*3]h為最佳水解時間，此時O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為[CM）]

[TPCFM2.tif；S+2mm][FK）]

47.11%，水解度為49.83%。

2.1.3加酶量對酶解效果的影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度均呈先增加、后減小的趨勢，兩者均在加酶量為8 000 U/g時達到最大值，此時O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為55.86%，水解度為55.31%。

[FK（W12][TPCFM3.tif；S+3mm][FK）]

2.2堿性蛋白酶正交試驗結果

堿性蛋白酶酶解卵白蛋白正交試驗結果見表2。O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力、水解度的方差分析分別見表3、表4。

由表2可知，堿性蛋白酶酶解卵白蛋白試驗中，各考察因素對O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力的影響大小順序為C（加酶量）>B（酶解時間）>A（底物質量分數(shù)），最優(yōu)組合為A1B3C1，即底物質量分數(shù)2%、酶解時間5 h、加酶量7 000 U/g；各考察因素對水解度的影響大小順序為C（加酶量）>A（底物質量分數(shù)）>B（酶解時間），最優(yōu)組合為A3B1C2，即底物質量分數(shù)4%、酶解時間3 h、加酶量8 000 U/g。

由表3、表4可知，各考察因素中，底物質量分數(shù)、酶解時間、加酶量對O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度的影響均不顯著。

通過對2個指標的極差和方差分析，在試驗主要研究酶解物抗氧化性的基礎上，最終選擇O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為主要參考指標，通過正交試驗得到蛋白酶酶解的最優(yōu)組合為A1B3C1，即底物質量分數(shù)2%、酶解時間5 h、加酶量7 000 U/g。

2.3最優(yōu)組合驗證

根據(jù)正交試驗結果，以DPPH自由基清除能力、還原力、羥基自由基活性、超氧陰離子清除率、抗脂質氧化能力為評價指標，分別對堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的最優(yōu)組合進行驗證。

在最佳條件下，堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的酶解多肽O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%，還原力、抗脂質過氧化能力分別為0.87、82.83%。此結果可為具體要求下酶解藏雞蛋卵白蛋白獲得酶解多肽提供依據(jù)。

3討論與結論

3.1討論

單因素試驗中，研究底物質量分數(shù)對酶解物水解度的影響時發(fā)現(xiàn)，酶解過程中酶解產(chǎn)物的水解度并不隨著底物質量分數(shù)的增加而增加，而是呈先增加、后減小的趨勢，這與郭剛軍等的研究結果一致，即堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解澳洲堅果粕制備多肽的過程中，水解度與底物濃度之間的現(xiàn)象[20]。這主要由于在酶解過程中，當?shù)孜餄舛仍谙鄬^低的范圍內變化時，酶的水解效率受底物濃度的限制，表現(xiàn)為水解度隨著底物濃度的增加而逐漸加大；但當?shù)孜餄舛瘸鲞@一范圍后，酶解液的黏度隨著底物濃度的增加而逐漸變大，蛋白質的溶出率會相應下降，過多的底物分子堆積于酶的活動中心，超過酶飽和時所需的底物濃度，進而影響酶催化速度及產(chǎn)物分子的擴散，從而表現(xiàn)為水解度隨著底物濃度的繼續(xù)升高而下降的現(xiàn)象。

單因素試驗中，研究酶解時間對酶解產(chǎn)物抗氧化活性和水解度的影響時發(fā)現(xiàn)，酶解過程中隨著酶解時間的延長，水解度越來越大，但抗氧化活性卻不是越來越強，而是呈先增加、后減小的趨勢。產(chǎn)生該現(xiàn)象主要是由于存在過度水解的情況，即在一定的水解時間后，隨著水解的繼續(xù)進行，一些具有抗氧化活性的肽段會被進一步水解，相應的抗氧化活性則消失，整體的抗氧化活性隨之下降[21]?？梢?，并不是水解越徹底則抗氧化活性越強。這也能解釋在其他因素的試驗結果中，有時也會存在水解度與O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率變化不一致的情況，表明水解度與O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率的變化沒有顯著相關性，這與李誠等、盛小波、焦寶利等的研究結果[22-24]一致，從另一角度說明多肽的抗氧化活性與肽鏈中暴露的氨基酸側鏈性質、肽的氨基酸序列有關。低水解度時，具有抗氧化活性的氨基酸殘基不能暴露，無法顯示抗氧化活性；水解度過高時，具有抗氧化活性的肽被進一步水解，抗氧化活性結構被破壞，活性降低[22，25]。

單因素試驗中，研究加酶量對酶解物抗氧化活性和水解度的影響時發(fā)現(xiàn)，加酶量并不是越多越好，在一定范圍內，抗氧化活性與水解度均隨著酶添加量的增加而增加，但超過這一范圍酶添加量繼續(xù)增加時，抗氧化活性與水解度反而下降。這可能是由于在一定范圍內，隨著酶量的增加，底物與酶的接觸面積增大，酶解反應速率相應提高，酶解程度越來越大；但當加酶量超過最佳值后，可能由于酶的過量加入造成整個酶解液性質的改變，如造成黏度增加而使酶與底物的結合受到影響等，從而導致水解度和抗氧化活性下降，具體原因有待進一步研究。

3.2結論

以O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度為指標，通過單因素試驗與正交試驗，得出堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的最佳條件為底物質量分數(shù)2%、酶解時間5 h、加酶量7 000 U/g。

對最優(yōu)組合進行驗證，在最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%，還原力、抗脂質過氧化能力分別為0.87、82.83%。該數(shù)據(jù)為針對性地酶解藏雞蛋卵白蛋白制備抗氧化多肽提供了依據(jù)。

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