丁忠陽(yáng)，許飛，唐建東，李淦，蔣盤強(qiáng)，吳昊天，唐張峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214071)

藤黃酸對(duì)耐藥胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響及機(jī)制

丁忠陽(yáng)，許飛，唐建東，李淦，蔣盤強(qiáng)，吳昊天，唐張峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無(wú)錫214071)

目的 探討藤黃酸對(duì)耐藥胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響及機(jī)制。方法 取處于對(duì)數(shù)期的耐吉西他濱的胃癌細(xì)胞(R-MKN28)，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組和藤黃酸+IL-6組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組予藤黃酸2.0 μg/mL，藤黃酸+IL-6組在藤黃酸處理的基礎(chǔ)上加用IL-6 10 ng/mL 處理。用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell和生物信息學(xué)等方法觀察藤黃酸對(duì)R-MKN28細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。并通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達(dá)，采用ELISA法檢測(cè)IL-6蛋白表達(dá)。結(jié)果 藤黃酸干預(yù)至72 h時(shí)，Blank組492 nm處吸光度值由0 h的0.472±0.012升高到0.988±0.031，而藤黃酸組只由0 h的0.409±0.008上升至0.762±0.022，兩組比較，P<0.01。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，Blank組凋亡率為(14.25±1.352)%；藤黃酸組凋亡率為(23.48±1.574)%，兩組比較，P<0.05。Transwell 結(jié)果顯示，Blank組穿膜細(xì)胞數(shù)為(61.67±7.265)個(gè)/視野，而藤黃酸組穿膜細(xì)胞數(shù)為(29.68±5.487)個(gè)/視野，兩組比較，P<0.05。藤黃酸組R-MKN28細(xì)胞的IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達(dá)水平表達(dá)下降，IL-6蛋白表達(dá)減少(P均<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃酸+IL-6組細(xì)胞增殖能力相比藤黃酸組在48 h后明顯上升(P<0.05)。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃酸+IL-6組穿膜細(xì)胞數(shù)為(60.00±4.619)個(gè)/視野，而藤黃酸組僅為(27.00±5.859)個(gè)/視野，兩組比較，P<0.05。生物信息學(xué)分析表明耐吉西他濱的胃癌細(xì)胞中IL-6水平表達(dá)升高。結(jié)論 藤黃酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6水平抑制耐吉西他濱的 R-MKN28 細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)凋亡。

胃癌；耐藥癌細(xì)胞；藤黃酸；白細(xì)胞介素6

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率逐年上升，病死率較高。外科手術(shù)是目前最有效的治療方法，但我國(guó)胃癌的早期診斷率低，確診時(shí)大部分患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)；另外，50%～70%進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后可出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]?；熓且环N全身性治療手段，對(duì)潛在轉(zhuǎn)移灶和臨床已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌灶均有作用。因此，化療已成為患者術(shù)后輔助性治療和晚期不適于手術(shù)患者姑息治療的主要方式。但隨著化療藥物的持續(xù)治療，患者機(jī)體可產(chǎn)生不同程度的耐藥導(dǎo)致化療效果下降甚至無(wú)效[3]。在我國(guó)，中醫(yī)藥治療癌癥的方式被廣泛采用，且取得較好效果[4]。2014年9月，我們采用藤黃酸中藥單體處理胃癌耐藥細(xì)胞，觀察藤黃酸對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞耐吉西他濱的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 藤黃酸粉劑(純度99%)和MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，溶解分裝后保存于-20 ℃。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)材料購(gòu)于美國(guó)Corning公司。人胃癌耐吉西他濱細(xì)胞系R-MKN28由Saiki Y 教授饋贈(zèng)，R-MKN28 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和雙抗(100 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃含5% CO2孵箱中。TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司。PCR相關(guān)試劑購(gòu)于大連寶生生物公司。IL-6的ELISA試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期R-MKN28細(xì)胞傳代接種于96孔板(1×103個(gè)/孔)。待細(xì)胞貼壁后，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入100 μL溶解的藤黃酸溶液，使藤黃酸終濃度為2.0 μg/mL，此時(shí)記為0 h。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0、24、48 h和72 h加入20 μL/孔MTT試劑，放入孵箱再培養(yǎng)4 h，取出96孔板，用注射器小心吸走細(xì)胞培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，避光振搖10 min，上機(jī)于492 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度值(OD值)。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期R-MKN28細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)為8×105個(gè)/孔。12 h細(xì)胞貼壁后，分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入藤黃酸溶液，使其終濃度為2.0 μg/mL。培養(yǎng)48 h后將細(xì)胞用胰酶消化后收集至15 mL離心管，保證每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)≥106。用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。加入 Anexin V 和 PI 進(jìn)行孵育(注意避光)。送實(shí)驗(yàn)中心流式平臺(tái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) R-MKN28細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入藤黃酸2.0 μg/mL進(jìn)行干預(yù)。24 h后將細(xì)胞胰酶消化后收集于離心管，1 000 r/min，離心3 min。PBS洗滌1次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將400 μL共5×105個(gè)細(xì)胞加入懸掛于24孔板上的Transwell小室上室。下室為20% FBS培養(yǎng)基600 μL。24 h后取出Transwell小室，PBS洗滌2次，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色。鏡下觀察每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算每個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)目。

1.5 R-MKN28細(xì)胞中IL-6、JAK1、BCL2和AKT1基因表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。R-MKN28 細(xì)胞分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入藤黃酸2.0 μg/mL進(jìn)行干預(yù)。36 h后使用TRIzol提取細(xì)胞RNA。取2 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按qRT-PCR試劑盒操作說(shuō)明，依次加入模板、引物和預(yù)混SYBGREEN 等試劑進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá)，依照2-ΔΔCT計(jì)算。引物序列IL-6上游引物5′-CTCAATATTAGAGTCTCAACCCCCA-3′，下游引物5′-GAGAAGGCAACTGGACCGAA-3′；JAK1上游引物5′-GCATCGAGCGCACAAAGTTAT-3′，下游引物5′-ACCAGTAGGGTTGAGGGACA-3′；BCL2上游引物5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′，下游引物5′-ACTTGTGGCCCAGATAGGCA-3′；AKT1上游引物5′-GAAGGACGGGAGCAGGCG-3′，下游引物5′-TGTACTCCCCTCGTTTGTGC-3′。

1.6 IL-6蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA法。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 R-MKN28細(xì)胞接種于 6 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)。待細(xì)胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入終濃度為2.0 μg/mL的藤黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后加入裂解液進(jìn)行蛋白抽提，抽提完成后加入已包被的板子，加入200 μL抗IL-6的酶標(biāo)抗體，室溫放置2 h。洗滌液清洗4 次，每孔加200 μL 底物進(jìn)行顯色。室溫反應(yīng)20 min，每孔加入50 μL反應(yīng)終止液，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)。

1.7 生物信息學(xué)分析 芯片數(shù)據(jù)來(lái)源為GEO數(shù)據(jù)平臺(tái)上 GEO accession 為 GSE58118 數(shù)據(jù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58118)。該基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)包含4個(gè)樣本，其中2個(gè)R-MKN28細(xì)胞樣本，2 個(gè)耐吉西他濱的R-MKN28細(xì)胞樣本。芯片數(shù)據(jù)下載后對(duì)數(shù)據(jù)整理，使用斯坦福大學(xué)開(kāi)發(fā)的SAM軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)分析，采用heatmap illustrator軟件導(dǎo)出熱圖。

1.8 藤黃酸處理R-MKN28后加入IL-6重組蛋白對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 R-MKN28細(xì)胞接種于 6 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)。待細(xì)胞貼壁后分為未處理組(Blank組)、藤黃酸組、藤黃酸+IL-6組，Blank組不予任何干預(yù)，藤黃酸組加入終濃度為2.0 μg/mL的藤黃酸，藤黃酸+IL-6組予藤黃酸2.0 μg/mL及重組IL-6蛋白10 ng/mL，細(xì)胞增殖能力檢測(cè)同1.2，細(xì)胞遷移能力檢測(cè)同1.4。

2 結(jié)果

2.1 藤黃酸對(duì)R-MKN28細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響 加入藤黃酸后R-MKN28細(xì)胞增殖于24 h后明顯降低(P<0.05)，且至72 h此現(xiàn)象更明顯(P<0.01)；R-MKN28細(xì)胞凋亡增加(P<0.05)；藤黃酸組R-MKN28 細(xì)胞穿膜數(shù)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力比較(±s)

2.2 藤黃酸處理后R-MKN28 細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化 qRT-PCR 結(jié)果顯示，加入藤黃酸后 R-MKN28細(xì)胞IL-6基因表達(dá)水平相比Blank組的4.333下降至1.167、JAK1相比Blank組的 2.786下降至1.133、BCL2相比Blank組的3.300下降至1.000和AKT1相比Blank組的3.300下降至0.933；藤黃酸組IL-6 蛋白表達(dá)(111.333 ng/mL)相比Blank組的(169.000 ng/mL)亦下降(P均<0.05)。

2.3 耐吉西他濱胃癌的生物信息學(xué)分析 下載 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)GEO accession 為 GSE58118 的基因芯片進(jìn)行分析表明，耐吉西他濱胃癌細(xì)胞相比不耐藥細(xì)胞株IL-6基因水平表達(dá)明顯增高。

2.4 藤黃酸處理R-MKN28 后恢復(fù)IL-6水平對(duì)R-MKN28細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 加入重組IL-6后R-MKN28細(xì)胞增殖和遷移能力均有不同程度恢復(fù)(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞在恢復(fù)IL-6水平后增殖和遷移能力比較(±s)

3 討論

晚期胃癌是目前外科臨床研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)。尤其是經(jīng)過(guò)多重化療后，部分患者出現(xiàn)對(duì)常規(guī)化療方案的耐藥，治療棘手[5]。吉西他濱是一種人工合成的嘧啶類核苷藥物，其主要作用機(jī)制是干擾細(xì)胞NDA周期，為周期特異性藥物。吉西他濱目前已大范圍用于食管癌、乳腺癌和原發(fā)性肝癌等多種腫瘤的治療[6]。關(guān)于吉西他濱治療胃癌的文獻(xiàn)較多，其中多數(shù)研究認(rèn)為吉西他濱對(duì)胃癌無(wú)明顯作用[7]。

藤黃酸為藤黃科植物分泌的干燥樹(shù)脂藤黃中主要成分。中醫(yī)古籍記載藤黃具有消炎、抑菌、止血、抗病毒等作用，常被用于膿腫、跌打損傷和各種體蘚的治療中。藤黃酸是橙黃色無(wú)定形粉末，具有光學(xué)性，相對(duì)分子質(zhì)量為628.76 kD。藥理學(xué)研究表明藤黃酸具有抗腫瘤作用，可抑制多種癌癥的增殖、遷移、侵襲。藤黃酸可通過(guò)線粒體氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放來(lái)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[8]，通過(guò)將肺癌細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[9]。本研究結(jié)果顯示，耐吉西他濱胃癌細(xì)胞R-MKN28加入藤黃酸后，細(xì)胞增殖明顯下降，且呈時(shí)間依賴性；細(xì)胞凋亡增加；細(xì)胞遷移能力降低?？梢?jiàn)藤黃酸可影響耐吉西他濱的胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為，抑制耐吉西他濱的胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藤黃酸可降低R-MKN28細(xì)胞IL-6基因和蛋白及其下游基因水平。IL-6是一種可由多種細(xì)胞分泌的多功能因子。在多種腫瘤的宿主防御和癌細(xì)胞生長(zhǎng)中起中心作用。在胃癌中，IL-6可通過(guò)激活c-Src/RhoA/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)胃癌的侵襲[10]。IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch 信號(hào)通路是曲妥單抗治療胃癌發(fā)揮作用的重要信號(hào)通路，亦是胃癌耐曲妥單抗的主要靶點(diǎn)[11]。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明在耐吉西他濱的胃癌細(xì)胞中IL-6表達(dá)水平明顯升高，而加入藤黃酸后IL-6表達(dá)水平下降，且在使用重組IL-6后R-MKN28生物學(xué)行為又朝惡性程度方向發(fā)展。

綜上所述，雖然多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道吉西他濱不能用于胃癌治療，但此研究中我們加入了中藥單體藤黃酸后，胃癌細(xì)胞增殖、遷移能力下降，凋亡增多。此可能成為吉西他濱治療胃癌的一個(gè)突破口，但具體機(jī)制尚需深入研究。

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2015年度無(wú)錫市科技發(fā)展資金項(xiàng)目(CSE31N1513)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.012

R735.2

A

1002-266X(2017)09-0039-03

2016-07-01)