陳鐘 張美 徐勇

1.廈門醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廈門 361008；2.山東省高青縣人民醫(yī)院口腔科，高青 256300

·口腔腫瘤學(xué)專欄·

P120-連環(huán)蛋白介導(dǎo)鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換促進口腔鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲的實驗研究

陳鐘1張美2徐勇1

1.廈門醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廈門 361008；2.山東省高青縣人民醫(yī)院口腔科，高青 256300

目的 探索P120-連環(huán)蛋白（P120ctn）在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換中的作用及其對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響。方法采用質(zhì)粒pGFP-V-RS-P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染OSCC細胞株TSCCA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot檢測細胞中P120ctn、E-鈣黏蛋白（E-cad）和N-鈣黏蛋白（N-cad）的mRNA和蛋白表達的變化，通過Transwell細胞侵襲及細胞遷移實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果質(zhì)粒pGFP-V-RSP120ctnshRNA轉(zhuǎn)染TSCCA細胞后，P120ctn表達明顯降低，E-cad的mRNA和蛋白表達水平也明顯降低，而N-cad的mRNA和蛋白表達水平明顯提高，細胞遷移和侵襲能力也明顯提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在OSCC中P120ctn可能通過介導(dǎo)鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換來調(diào)節(jié)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程。

P120-連環(huán)蛋白； 鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換； 口腔鱗狀細胞癌

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移包含多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，過程復(fù)雜，步驟繁多，其中細胞黏附能力下降是一個重要環(huán)節(jié)。鈣黏蛋白是一種鈣離子依賴型細胞黏附分子。口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell cancer， OSCC）發(fā)生發(fā)展過程中有鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并且與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[1]。鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，是指上皮細胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表達的喪失和N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）等間質(zhì)鈣黏蛋白表達的上調(diào)，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要步驟。研究[2]表明，P120-連環(huán)蛋白（P120-catenin，P120ctn）和E-cad可能通過調(diào)節(jié)細胞黏附調(diào)控OSCC浸潤和轉(zhuǎn)移，但與鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化的關(guān)系尚未闡明。本研究通過基因轉(zhuǎn)染方法，探討P120ctn在OSCC細胞株TSCCA鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換中的作用及其對細胞遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

鼠抗人P120ctn單克隆抗體、鼠抗人E-cad單克隆抗體（Abcam公司，美國），兔抗人N-cad多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）。pGFP-V-RS-P120ctnshRNA（Origene公司，加拿大），X-treme Gene HP DNA轉(zhuǎn)染試劑（Roche公司，瑞士）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司，美國），TRIzol試劑（Invitrogen公司，加拿大），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）。CO2培養(yǎng)箱（Thermal公司，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Corbett公司，美國），Transwell小室（Corning公司，美國）。

1.2 基因轉(zhuǎn)染及篩選

細胞培養(yǎng)皿中接種約3×105個TSCCA細胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h。100 μL DMEM無血清培養(yǎng)基溶解1 μg pGFP-V-RS-P120ctnshRNA質(zhì)粒和3 μL轉(zhuǎn)染試劑，然后將混合物加入TSCCA細胞中，輕柔混勻，15～25 ℃孵育30 min。37 ℃孵育24 h后施加篩選壓力，改用含0.8 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。反復(fù)篩選2～3周后，收集具有嘌呤霉素抗性的細胞克隆增殖，命名為TSCCA/shP120ctn細胞，對照組為未做任何處理的TSCCA細胞。

1.3 實時熒光定量PCR

引物合成委托上海生工生物工程公司完成。采用指數(shù)生長期細胞抽提總RNA，定量逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為Oligo dT primer（50 μmol·L-1）1 μL，dNTP Mixture 1 μL，Total RNA 5 μg，加入不含RNA酶dH2O補至10 μL，在PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：42 ℃ 15 min，70 ℃ 30～60 min，-20 ℃保存。PCR擴增反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，93 ℃預(yù)變性30 s，59 ℃變性45 s，72 ℃退火60 s，71 ℃延伸7 min，35個循環(huán)。

1.4 Western blot

收獲指數(shù)生長期細胞的蛋白質(zhì)，提取蛋白上樣，加入瓊脂糖凝膠，10 mA電泳2 h，根據(jù)相對分子質(zhì)量Marker截取目的條帶，100 V衡壓1 h，濕轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃搖動孵育過夜，洗去一抗，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記IgG與濾膜一同溫育洗膜曝光。

1.5 Transwell細胞侵襲及細胞遷移實驗

遷移實驗采用培養(yǎng)基和Transwell小室，置于37 ℃條件下溫育。消化對數(shù)生長期的TSCCA和TSCCA/ shP120ctn細胞，加入無血清培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度為每毫升2×105個，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入800 μL含20%FBS的培養(yǎng)基，48 h后進行固定、染色，計算并統(tǒng)計結(jié)果。侵襲試驗在Transwell上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育4 h使其干成膠狀，后續(xù)步驟同遷移試驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用方差分析法，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染對TSCCA細胞鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換的影響

用質(zhì)粒pGFP-V-RS-P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染TSCCA細胞后發(fā)現(xiàn)，隨著P120ctn表達的顯著降低，E-cad的mRNA和蛋白表達水平明顯降低，N-cad的mRNA和蛋白水平則明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 P120ctnmRNA、E-cad mRNA和N-cad mRNA在TSCCA和TSCCA/shP120ctn細胞中的表達Fig1 Expression of P120ctnmRNA, E-cad mRNA and N-cad mRNA in TSCCA and TSCCA/shP120ctn

2.2 P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染對TSCCA細胞遷移和侵襲能力的影響

利用無基質(zhì)膠以及有基質(zhì)膠Transwell實驗檢測TSCCA細胞轉(zhuǎn)染P120ctnshRNA前后遷移和侵襲能力的變化，結(jié)果見圖3。轉(zhuǎn)染前，遷移實驗穿過Transwell小室微孔的細胞數(shù)量為每視野59個，侵襲實驗為52個；轉(zhuǎn)染后，遷移實驗為每視野119個，侵襲實驗為102個，可見TSCCA細胞轉(zhuǎn)染P120ctnshRNA后遷移和侵襲能力顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 P120ctn、E-cad和N-cad蛋白在TSCCA和TSCCA/shP120ctn細胞中的表達Fig2 Expression of P120ctn, E-cad and N-cad protein in TSCCA and TSCCA/shP120ctn

圖3 TSCCA細胞和TSCCA/shP120ctn細胞的遷移和侵襲能力對比Fig3 Contrast of migration and invasion capacity of TSCCA and TSCCA/shP120ctn

3 討論

鈣黏蛋白是鈣依賴的細胞與細胞之間粘連作用關(guān)鍵的細胞黏附調(diào)節(jié)分子，目前已發(fā)現(xiàn)30多種鈣黏蛋白，分布于不同的組織細胞上，如上皮細胞的E-cad、神經(jīng)細胞的N-cad和胎盤滋養(yǎng)層細胞的P-鈣黏蛋白（P-cadherin，P-cad）以及心肌細胞上的N-cad等。腫瘤細胞之間通過鈣黏蛋白的作用而發(fā)生黏附，聚集成團，不易脫落進入周圍組織。腫瘤的轉(zhuǎn)移首先是腫瘤細胞從原發(fā)灶的脫落，因此與鈣黏蛋白的作用密切相關(guān)。如果鈣黏蛋白的表達異常，就會使這種黏附作用削弱，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

P120ctn是連環(huán)蛋白家族的新成員，參與細胞黏附和信號傳導(dǎo)，通過與經(jīng)典鈣黏蛋白，包括E-cad、N-cad和P-cad的胞內(nèi)肽段近膜端（juxtamembrane domain，JMD）結(jié)合形成連環(huán)蛋白-鈣黏蛋白復(fù)合體（cadherin catenin complex，CCC）。P120ctn不同于其他幾種連環(huán)蛋白，它與經(jīng)典鈣黏蛋白之間的連接并不緊密，因此P120ctn的主要作用在于調(diào)節(jié)而非物理性連接[3]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-cad的mRNA和蛋白表達水平在P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染舌癌原發(fā)灶細胞TSCCA后明顯降低。P120ctn蛋白水平的降低或P120ctn與E-cad結(jié)合的喪失使之從CCC脫離，導(dǎo)致鈣黏蛋白的內(nèi)吞，內(nèi)吞的鈣黏蛋白或者被溶酶體降解，或者通過與P120ctn結(jié)合和RAS小GTP結(jié)合蛋白1（a small GTP-binding protein of the RAS，Rap1 GTPase）被回收到細胞膜，因此P120ctn對于E-cad這種動靜結(jié)合的調(diào)節(jié)是非常重要的。P120ctn與E-cad結(jié)合的關(guān)鍵部位同時也是磷酸化位點，P120ctn上Y228位點的磷酸化與OSCC的發(fā)生密切相關(guān)[4]，幾個酪氨酸和絲氨酸位點的磷酸化都與鈣黏蛋白的活化和黏附能力相關(guān)[5]，P120ctn可能就是通過磷酸化調(diào)節(jié)了E-cad的結(jié)合和穩(wěn)定性，從而影響CCC的穩(wěn)定性，使細胞黏附能力發(fā)生異常。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，P120ctnshRNA轉(zhuǎn)染TSCCA后，隨著E-cad表達水平的降低，N-cad的表達水平顯著增高，且TSCCA細胞遷移和侵襲的能力顯著增高，提示N-cad的表達和鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換可能與OSCC的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與前人的研究結(jié)果一致。Byrd等[1]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察了93例OSCC病理切片，發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換的發(fā)生與OSCC患者的預(yù)后不良有相關(guān)性。在許多實體腫瘤中，腫瘤細胞都發(fā)生了鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換，并且被認為是腫瘤侵襲的起始步驟[6-8]，并且，E-cad表達下調(diào)而N-cad表達上調(diào)的“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲，并與不良預(yù)后有關(guān)[9-10]。

在鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換機制的研究[11]中發(fā)現(xiàn)，如果在上皮細胞中強制表達N-cad，則內(nèi)生性E-cad加速降解，表達水平下調(diào)。在A431細胞中，強制表達R-鈣黏蛋白（R-cadherin，R-cad）導(dǎo)致了內(nèi)生性E-cad和P-cad的降解，這種降解是因為鈣黏蛋白競爭性結(jié)合于P120ctn所致[12]。鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換可能發(fā)生在某一個鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之后，生長因子諸如轉(zhuǎn)化生長因子β導(dǎo)致了E-cad的轉(zhuǎn)錄抑制，也通過釋放P120ctn，使之結(jié)合于N-cad，間接提高了N-cad的表達，并將其穩(wěn)定于細胞表面[13]。

鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化過程中腫瘤細胞的惡性行為可能與N-cad/血小板衍生生長因子受體的相互作用或N-cad/成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）的相互作用有關(guān)。前者可能誘導(dǎo)了EMT過程中的一些重要事件，包括肌動蛋白重組、增殖和遷移；后者可能通過與成纖維細胞生長因子結(jié)合抑制了FGFR的內(nèi)化，活化了絲裂原活化蛋白激酶，提高了細胞運動能力，促進了基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌和腫瘤細胞的侵襲。

綜上所述，由本研究結(jié)果可以推測，在OSCC中P120ctn可能通過介導(dǎo)鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換參與調(diào)節(jié)OSCC的浸潤和轉(zhuǎn)移。

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（本文編輯 吳愛華）

Cadherin switching induced by P120-catenin can promote the migration and invasion of oral squamous cell cancer cells

Chen Zhong1, Zhang Mei2, Xu Yong1. (1. Dept. of Stomatology, Xiamen Medical College, Xiamen 361008, China; 2. Dept. of Stomatology, Gaoqing People’s Hospital in Shandong Province, Gaoqing 256300, China)

Objective The main goal is to investigate the role of P120-catenin (P120ctn) in cadherin switching, as well as migration and invasion, of oral squamous cell cancer (OSCC) cells.MethodsThe plasmid pGFP-V-RS-P120ctnshRNA was used to transfect TSCCA cells and significantly reduce the expression of P120ctnin these cells. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blot were conducted to determine the mRNA and protein expression levels of P120ctn, E-cadherin (E-cad), and N-cadherin (N-cad). By contrast, the Transwell cell invasion and cell migration assay was used to determine the invasion and migration capacities before and after the transfection.ResultsAfter the plasmid pGFPV-RS-P120ctnshRNA was transfected into the TSCCA cells, we found that as the P120ctnexpression significantly decreased, E-cad mRNA and protein expression decreased significantly. Moreover, N-cad mRNA and protein expression increased significantly (P＜0.05). Lastly, the cell migration and invasion capacities were augmented significantly (P＜0.05). Conclusion In OSCC cells, P120ctnmay be involved in cadherin switching and promote metastasis and invasion.

P120-catenin; cadherin switching; oral squamous cell cancer

R 739.8

A

10.7518/hxkq.2017.02.014

Supported by: Project Supported by Natural Science Foundation of Xiamen Medical College (2013-02). Correspondence: Chen Zhong, E-mail: 310571932@qq.com.

2016-10-15；

2016-12-22

廈門醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金（Z2013-02）

陳鐘，副教授，博士，E-mail：310571932@qq.com

陳鐘，副教授，博士，E-mail：310571932@qq.com