杜樣 袁帥 周志斐 鄔禮政 汪璐璐 吳興安 王小競

1.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院兒童口腔科，西安 710032；2.武警后勤學院附屬醫(yī)院口腔科，天津 300300；3.第四軍醫(yī)大學微生物學教研室，西安 710032

尼古丁調控人牙周膜細胞自噬水平的實驗研究

杜樣1袁帥1周志斐1鄔禮政2汪璐璐1吳興安3王小競1

1.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院兒童口腔科，西安 710032；2.武警后勤學院附屬醫(yī)院口腔科，天津 300300；3.第四軍醫(yī)大學微生物學教研室，西安 710032

目的 探討尼古丁對人牙周膜細胞（hPDLCs）自噬水平的影響。方法選取因正畸治療而拔除的前磨牙，采用組織塊法分離培養(yǎng)hPDLCs。通過Western blot法篩選尼古丁影響hPDLCs自噬的最佳作用時間及濃度，使用透射電子顯微鏡（TEM）和免疫熒光染色法檢測該作用時間及濃度下hPDLCs自噬體形成情況和自噬標志蛋白LC3的表達情況。結果LC3Ⅱ蛋白表達在尼古丁作用的12 h內持續(xù)升高，從而確定12 h為最佳作用時間；LC3Ⅱ蛋白表達上調具有尼古丁濃度依賴性，1×10-5mol·L-1為尼古丁最佳作用濃度。TEM和免疫熒光染色證實尼古丁在此濃度及作用時間下hPDLCs細胞質內自噬體的數(shù)量增加，自噬標志蛋白LC3表達升高。結論在一定條件下，尼古丁能夠上調hPDLCs自噬水平，為進一步研究細胞自噬與吸煙相關牙周炎的關系奠定了基礎。

人牙周膜細胞； 尼古??； 自噬

近年來，流行病學調查和臨床病例研究[1-2]均證實，吸煙是牙周炎發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。吸煙者牙周炎患病率高、病情重，且治療效果和預后均較差。尼古丁作為煙草中的主要毒性物質，除能影響牙周膜細胞的增殖分化能力外[3]，還可調控細胞因子的釋放，發(fā)揮間接性組織破壞作用[4]。

自噬是真核細胞的一種高度保守的生物學行為，是細胞自體吞噬、消化的過程。自噬過程中，細胞通過雙層膜結構包裹受損的蛋白質和細胞器，運送到溶酶體中進行代謝，緩解應激壓力，維持代謝平衡。在低氧、營養(yǎng)匱乏等不利微環(huán)境下，細胞通過激活、上調自噬水平來降解細胞內蛋白聚集體、氧化脂質、受損細胞器等物質以維持活性[5-6]。

尼古丁可以通過調控多種細胞自噬水平參與機體的病理生理過程。研究[7]證實，尼古丁可以激活神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY-5Y的自噬水平，在臍靜脈內皮細胞中可以激活內皮細胞自噬[8]。目前關于尼古丁與人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）自噬的關系尚不明確，但有研究[9]發(fā)現(xiàn)，與細胞自噬有關的機制參與了牙周炎癥的損傷過程。在有關細胞自噬的研究中，常通過檢測自噬體數(shù)量及自噬標志蛋白等手段評價自噬水平。自噬體是雙層膜包被的圓形或橢圓形結構，內含細胞質、蛋白質、損傷細胞器等[10]。LC3是常見的哺乳動物自噬體分子標志物，存在兩種可互相轉化的形式，即LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ位于自噬體囊泡的膜表面[11]，隨自噬體膜的增多而增多。本研究通過觀察尼古丁對hPDLCs自噬體形成情況和自噬標志蛋白LC3表達情況的影響，探索吸煙與牙周炎在發(fā)病機制方面的關系，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基、PBS（Coning公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），0.25%胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、預染蛋白Marker（上海生工生物工程有限公司），兔抗人LC3抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），山羊抗兔抗體（Odyssey公司，美國），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記山羊抗兔抗體（北京康為世紀生物科技有限公司）。BCA蛋白濃度檢測試劑盒（Thermo公司，美國），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳及轉移系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），Odyssey掃描儀（LiCor公司，美國），分光光度計（Jenway公司，英國），熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs培養(yǎng) 收集第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院頜面外科門診因正畸減數(shù)而新鮮拔除的健康前磨牙（患者年齡12～18歲），要求牙齒無齲壞以及牙周疾患，供者無全身系統(tǒng)性疾病。PBS和低糖DMEM反復多次沖洗牙齒后，無菌手術刀片刮取根中1/3牙周膜組織，收集并離心，用含15%胎牛血清的DMEM重懸牙周膜組織沉淀接種于六孔板，無菌蓋玻片覆蓋。加入1.5～2.0 mL含15%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃恒溫孵箱培養(yǎng)，每3 d常規(guī)換液，待細胞增殖至板底面積90%時胰酶消化傳代，第4代hPDLCs用于后續(xù)實驗，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2.2 Western-blot檢測LC3Ⅱ蛋白的表達 取生長狀態(tài)良好的第4代hPDLCs，以每孔2×105個細胞的密度接種于六孔板中，待細胞生長至80%后分別給予1× 10-5mol·L-1的尼古丁作用0、3、6、12、24 h，PBS洗滌后每孔加入120 μL含1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑的細胞裂解液（ridio-immunoprecipition assay，RIPA），在冰上充分裂解后刮取細胞，將RIPA移至EP管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取所得上清采用BCA法測定蛋白質濃度，計算每孔總蛋白30 μg的上樣量。制備15%SDS-PAGE蛋白電泳凝膠，恒壓電泳結束后將蛋白恒流200 mA轉移至聚偏二氟乙烯膜，3%脫脂牛奶封閉1 h后孵育一抗，4 ℃過夜，二抗室溫避光孵育2 h后，避光掃膜。以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）或β-actin為內參，計算LC3Ⅱ與內參的灰度值的比值[12]，得出LC3Ⅱ蛋白的相對表達量。另取生長狀態(tài)良好的第4代hPDLCs接種至六孔板，分別給予各孔0、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol·L-1尼古丁作用12 h，其余步驟同前。以GAPDH或β-actin為內參，計算LC3Ⅱ與內參的灰度值的比值，得出LC3Ⅱ蛋白的相對表達量。

1.2.3 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察hPDLCs內自噬體的形成情況 取生長狀態(tài)良好的第4代hPDLCs，制備成密度為2× 105·mL-1細胞懸液，取2 mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至80%后，實驗組給予1×10-5mol·L-1尼古丁作用12 h，胰蛋白酶消化后制成密度為1×106·mL-1細胞懸液，4 ℃、1 200 r·min-1離心5 min后棄上清，加入1 mL預冷2.5%戊二醛固定，4 ℃過夜，根據(jù)文獻[13]的操作步驟進行后續(xù)實驗操作。

1.2.4 免疫熒光染色觀察LC3蛋白的表達 取生長狀態(tài)良好的第4代hPDLCs，以每孔2×104個細胞的密度接種于24孔板，待細胞生長至80%時給予1×10-5mol·L-1尼古丁作用12 h，4%預冷多聚甲醛固定20 min，0.5% TritonX-100通透10 min，3%BSA封閉30 min后加入一抗（1∶100）4 ℃過夜，二抗（1∶500）室溫避光孵育2 h，細胞用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）染核5 min，甘油封片后熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析檢驗組間差異，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)與鑒定

組織塊接種3～7 d以后可見細胞自邊緣爬出。hPDLCs呈長梭形，體積較大，胞體豐滿，核卵圓形，位于細胞質中央，具有成纖維樣細胞形態(tài)特征（圖1左），傳代后細胞排列成放射狀（圖1右）。2.2 尼古丁對hPDLCs LC3Ⅱ蛋白表達影響的時間及

濃度依賴性

Western blot結果提示，1×10-5mol·L-1尼古丁作用3 h后，與空白對照組相比，LC3Ⅱ表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且這一升高趨勢在12 h達到高峰（P＜0.01），LC3Ⅱ蛋白表達水平在尼古丁作用12 h后基本趨于穩(wěn)定，24 h組蛋白質表達情況與12 h組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2左），由此可以確定尼古丁的最佳作用時間為12 h。當作用時間為12 h時，隨著尼古丁濃度增加，hPDLCs中LC3Ⅱ的表達隨之增加，1×10-4mol·L-1組自噬現(xiàn)象最明顯（圖2右，P＜0.05），與1×10-5mol·L-1組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？紤]到尼古丁具有一定的細胞毒性[14]，從而確定1×10-5mol·L-1為尼古丁的最佳作用濃度。

圖1 培養(yǎng)的hPDLCs細胞形態(tài) 光學顯微鏡 × 100Fig1 The cell morphology of hPDLCs optical microscope × 100

圖2 Western blot檢測尼古丁誘導hPDLCs中LC3Ⅱ蛋白的表達情況Fig2 The expression of LC3Ⅱ protein of hPDLCs treated with nicotine or in control group was detected by Western blot

2.3 尼古丁作用后hPDLCs內自噬體的形成以及數(shù)量變化

1×10-5mol·L-1尼古丁作用hPDLCs 12 h后行TEM觀察，低倍鏡下可見，與對照組（圖3A）相比，實驗組（圖3C）hPDLCs細胞質內細胞器增多；高倍鏡下可見，對照組自噬體（圖3B紅色箭頭示）的數(shù)量明顯少于實驗組（圖3D紅色箭頭示）。

2.4 免疫熒光染色檢測尼古丁作用hPDLCs后LC3蛋白的表達變化

熒光顯微鏡觀察可見，1×10-5mol·L-1尼古丁作用12 h后，實驗組的細胞核周圍出現(xiàn)LC3熒光亮點（圖4紅色箭頭所示），熒光強度高且亮點多，提示細胞內有大量的自噬體形成；而對照組亮點分布少而彌散，提示細胞內自噬體較少。

圖3 對照組和實驗組hPDLCs的細胞質內細胞器和自噬體的數(shù)量及形態(tài)結構 TEMFig3 The quantity and form of autophagosomes of hPDLCs treated with nicotine or in control group TEM

圖4 尼古丁作用后hPDLCs內LC3蛋白的表達變化 熒光顯微鏡 × 400Fig4 Nicotine-induced the expression of LC3 in hPDLCs fluorescence microscope × 400

3 討論

hPDLCs是牙周膜中數(shù)量最多、功能最重要的細胞，其功能損傷可能導致牙周支持組織破壞。尼古丁是一種存在于茄科植物中的生物堿，為強致命毒物。本課題組前期研究[15-16]證實，尼古丁可特異性上調大鼠牙周組織和hPDLCs膜表面α7亞型煙堿型乙酰膽堿受體表達水平，從而激活下游多條炎癥和骨代謝相關信號通路，參與吸煙相關性牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。進一步研究[4]發(fā)現(xiàn)，尼古丁可激活hPDLCs中核因子-κB信號通路，調控下游炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-8的表達，進而參與吸煙促牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程。這些前期研究結果均提示尼古丁能夠加重吸煙相關性牙周炎牙周組織炎癥損傷的過程。

研究[9]發(fā)現(xiàn)，細胞自噬在炎癥相關性疾病中扮演著重要的角色，例如口腔臨床中常見的牙周炎。牙周炎患者常發(fā)生hPDLCs缺氧，導致hPDLCs自噬水平升高，使細胞發(fā)生自噬性死亡，同時伴隨大量細胞因子IL-1β、基質金屬蛋白酶-8（matrix metallo preteinases-8，MMP-8）的分泌，從而加重牙周炎癥反應[17]。An等[18]通過體外成功培養(yǎng)牙周炎患者的牙周膜干細胞，發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境下牙周膜干細胞的自噬標志物（LC3）和基因（Atg12/7）表達都顯著高于正常牙周膜組織來源的牙周膜干細胞。另有研究[9]發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者外周血單核細胞中的LC3、IL-1β、IL-18 mRNA表達水平都顯著高于正常人群。這些研究結果均提示，細胞自噬可能參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。結合本實驗結果和本課題組前期研究[4]的結果可以發(fā)現(xiàn)，尼古丁作用后細胞炎癥因子表達上調與自噬水平上調結果較為一致，同樣提示細胞自噬可能參與了局部微環(huán)境炎癥反應進程。

尼古丁與細胞自噬的關系已有研究予以證實。研究[19]發(fā)現(xiàn)，香煙提取物（主要成分為尼古丁）能顯著上調牙齦成纖維細胞的自噬水平。其他組織中同樣發(fā)現(xiàn)，尼古丁可作用于臍靜脈內皮細胞，通過上調內皮細胞的自噬水平影響細胞黏附[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在尼古丁的作用下，hPDLCs的細胞自噬標志物LC3蛋白表達顯著升高，與上述研究結果較為一致；此外本研究還通過TEM從組織學水平證實細胞質內自噬體的形態(tài)及數(shù)量變化同樣受尼古丁作用的影響。

從本研究可以看出，尼古丁能夠上調hPDLCs自噬水平，這為進一步探討吸煙相關牙周炎的發(fā)病機制和治療方法提供了依據(jù)。

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（本文編輯 吳愛華）

A preliminary study on the autophagy level of human periodontal ligament cells regulated by nicotine

Du Yang1, Yuan Shuai1, Zhou Zhifei1, Wu Lizheng2, Wang Lulu1, Wu Xing’an3, Wang Xiaojing1. (1. State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Dept. of Pediatric Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China; 2. Dept. of Stomatology, Affiliated Hospital of Logistics University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300300, China; 3. Dept. of Microbiology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

Objective To explore the effect of nicotine on the autophagy level of human periodontal ligament cells (hPDLCs).MethodsPeriodontal tissues collected from premolars for orthodontic treatment reasons were used to culture hPDLCs. Western blot analysis was performed to test the most optimal time and concentration of nicotine on the autophagy level of the hPDLCs. Transmission electron microscope and immunofluorescence observation were carried out to detect the form of autophagosomes and expression of autophagy related protein LC3 in hPDLCs under this optimal condition.ResultsProtein expression of LC3Ⅱ was up regulated with the 12 h nicotine stimulating. Besides that, the up regulation of the protein expression of LC3Ⅱ was concentration dependent and nicotine with a concentration of 1×10-5mol·L-1was the most optimal condition. Transmission electron microscope and immunofluorescence observations indicated that nicotine would activate the autophagy level of hPDLCs by increasing the number of autophagosomes and up regulating the expression of autophagy related protein LC3.ConclusionNicotine could increase autophagy level of hPDLCs, thus affecting the occurrence and development of smoking related periodontitis.

human periodontal ligament cells; nicotine; autophagy

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.02.017

Supported by: The General Program of National Nature Science Foundation of China (81470743). Correspondence: Wang Xiaojing, E-mail: wxjing@fmmu.edu.cn.

2016-11-05；

2017-01-02

國家自然科學基金面上項目（81470743，81670988）

杜樣，碩士，E-mail：duyangzizi@126.com

王小競，教授，博士，E-mail：wxjing@fmmu.edu.cn