● 高厚明 陳建平 石巧玲

小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用及其抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制※

● 高厚明*陳建平 石巧玲

目的：本研究旨在探討體外實(shí)驗(yàn)中小兒安神補(bǔ)腦顆粒在6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法：采用6-OHDA損傷PC12細(xì)胞制備PC12細(xì)胞氧化損傷模型。加入小兒安神補(bǔ)腦顆粒觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果：小兒安神補(bǔ)腦顆粒能抑制6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，顯著增加細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)和(GSH-Px)的活性，顯著減少細(xì)胞中的丙二醛(MDA)的含量，同時(shí)顯著提高PC12細(xì)胞核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化還原酶-1(NQO-1)的mRNA表達(dá)。結(jié)論：小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有包含作用，其機(jī)制可能與其促進(jìn)Nrf2基因表達(dá)，進(jìn)而提高抗氧化蛋白表達(dá)水平，減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

小兒安神補(bǔ)腦顆粒 氧化應(yīng)激 Nrf2 抗氧化蛋白

小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥是一種兒童行為障礙性疾病。臨床以多發(fā)性抽動(dòng)、爆發(fā)性發(fā)聲及猥褻語(yǔ)言、模仿言語(yǔ)伴奇癖生活方式為特征，呈復(fù)雜的、慢性神經(jīng)精神疾病的表現(xiàn)[1]。小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥是一種復(fù)雜的慢性現(xiàn)代病，因其病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，故治療尚未有突破性進(jìn)展。目前西醫(yī)治療該病主要采用神經(jīng)阻滯劑如氟哌啶醇治療，但其有效率僅為50%～70%左右。

中醫(yī)認(rèn)為，小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥的主要病因?yàn)楦物L(fēng)內(nèi)動(dòng)，風(fēng)痰上蒙，阻滯清竅，心神不寧，治療以祛風(fēng)化痰、補(bǔ)腦安神為原則。小兒安神補(bǔ)腦顆粒是課題組成員結(jié)合臨床體會(huì)，針對(duì)本病病機(jī)研制而成的中藥醫(yī)院制劑。臨床研究表明，小兒安神補(bǔ)腦顆粒是治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥的有效藥物，與對(duì)照組氟哌啶醇比較有顯著差異，遠(yuǎn)期效果也優(yōu)于氟哌啶醇，復(fù)發(fā)率明顯低于氟哌啶醇，克服了目前小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥西藥治療的缺陷[2]。但目前該制劑相關(guān)的作用機(jī)制尚未明確，因而限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中，通常伴隨腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)再生障礙和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺失等，小兒安神補(bǔ)腦顆粒是否能通過(guò)改善神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中常見(jiàn)的病理狀態(tài)而達(dá)到治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)建立PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)小兒安神補(bǔ)腦顆粒的抗氧化應(yīng)激作用，并評(píng)價(jià)小兒安神補(bǔ)腦顆粒是否通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路改善細(xì)胞防御體系。

1 材料

1.1 藥物和試劑 小兒安神補(bǔ)腦顆粒藥物組成：石菖蒲、遠(yuǎn)志、益智仁、膽南星、陳皮、半夏、羌活、石決明、礞石等。主要功效：滌痰止驚，補(bǔ)腦安神。取小兒安神補(bǔ)腦顆粒用蒸餾水完全溶解，將上清液調(diào)整為含生藥50mg·mL-1，調(diào)pH值為7.4，高壓滅菌后放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩OD、GSH-Px和MDA試劑盒購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物工程研究所。Nrf2、HO-1、NQO-1及內(nèi)參GAPDH引物均由由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞株 PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞置于DMEM高糖型培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基含1% L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素，10%胎牛血清)，低分化PC12細(xì)胞半貼壁，3天換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)其可進(jìn)行傳代，0.05%的胰酶消化液消化細(xì)胞1-2min，加入等量含血清的培養(yǎng)基終止消化，收取含細(xì)胞的培養(yǎng)液于15mL離心管以1500 r·min-1離心5min，棄盡含胰酶的培養(yǎng)液，細(xì)胞以1∶3-1∶5比例進(jìn)行傳代。以細(xì)胞密度在(1-2)×105/mL左右接種于的常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)24小時(shí)后換液，待細(xì)胞狀態(tài)較好，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組 實(shí)驗(yàn)分為(1)正常對(duì)照組。(2)6-OHDA應(yīng)激組：給予終濃度為120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24 h。(3)6-OHDA+小兒安神補(bǔ)腦顆粒實(shí)驗(yàn)組：分別給予終濃度為0.1、0.4、1.6、6.4mg·L-1的小兒安神補(bǔ)腦顆粒提取液，24h后給予終濃度為120 μmol·L-1的6-OHDA，作用24h。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 按上述實(shí)驗(yàn)分組作用24h后，每孔加入濃度為5mg·mL-1的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸去上清液，每孔加入100 μL的二甲基亞砜，37℃孵育1h后，酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值。

2.4 SOD和MDA檢測(cè) 收集細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液，3000 r·min-1離心10 min，移去上清，PBS清洗后用含EDTA和TtitonX-100的PBS緩沖液進(jìn)行裂解，3000 r·min-1離心15min，收集上清液，按照SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

2.5 RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑裂解細(xì)胞。吸取裂解液于1.5mL離心管中，室溫放置5-10min。接著加入0.2mL三氯甲烷，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。之后12000r·min-1離心10min。吸取上清水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min。12000 r·min-1離心10min，棄上清。底部出現(xiàn)的白色沉淀即RNA。加入1mL 75% 乙醇洗滌沉淀。12000 r·min-1離心3min，棄上清。室溫干燥5-10min。加入30-50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA后將溶液置于-80℃保存。按照熒光定量試劑盒測(cè)定Nrf2、HO-1、NQO-1及內(nèi)參GAPDH表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖的影響 6-OHDA應(yīng)激組細(xì)胞存活率顯著低于正常組(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小兒安神補(bǔ)腦顆粒提取液處理后，細(xì)胞存活率較6-OHDA應(yīng)激組顯著提高(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響±s，n=8)

注：與正常組比較，##P<0.01；與6-OHDA應(yīng)激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px和MDA的影響 6-OHDA應(yīng)激組細(xì)胞SOD和GSH-Px活性較正常組顯著降低(P<0.01；P<0.01)，MDA釋放較正常組顯著增加(P<0.01)。0.4 mg·L-1、1.6 mg·L-1、6.4 mg·L-1小兒安神補(bǔ)腦顆粒提取液處理后，SOD和GSH-Px活性較6-OHDA應(yīng)激組顯著提高(P<0.05或P<0.01)，MDA釋放較6-OHDA應(yīng)激組顯著降低(P<0.05；P<0.01；P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px和MDA活性的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與6-OHDA應(yīng)激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Nrf2、HO-1和NQO-1的影響 6-OHDA應(yīng)激組細(xì)胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)較正常組顯著降低(P<0.05；P<0.05；P<0.05)。小兒安神補(bǔ)腦顆粒提取液處理后，Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)較6-OHDA應(yīng)激組顯著提高(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)PC12細(xì)胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)的影響

注：與正常組比較，#P<0.05；與6-OHDA應(yīng)激組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

中醫(yī)將神經(jīng)系統(tǒng)疾病定義為“生理性腎虛”，補(bǔ)腎從古至今都被認(rèn)為是防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要治法[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精，主骨生髓，髓通于腦，腦為髓?！薄Ｒ虼四X髓是否充足和腎之盛衰具有緊密的聯(lián)系。腎旺盛則腦髓充足，腎衰虧虛則腦髓缺乏，從而導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生病變，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我院根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實(shí)踐，以補(bǔ)腎益腦、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)化痰、鎮(zhèn)靜止驚為治制成以石菖蒲、遠(yuǎn)志、益智仁、膽南星、陳皮、半夏為主的小兒安神補(bǔ)腦顆粒，對(duì)小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥療效良好。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物[4]。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要因素[5]。氧化應(yīng)激情況下，SOD和GSH-Px等抗氧化物酶活性下降，導(dǎo)致眾多的氧自由基得不到及時(shí)清除，形成羥自由基，從而加重了氧化反應(yīng)：羥自由基繼而引發(fā)花生四烯酸的過(guò)氧化，生成大量的MDA，引起細(xì)胞增殖的下降[6]。本研究中小兒安神補(bǔ)腦顆?？梢赞卓?-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性表達(dá)下降，降低MDA的釋放，維持PC12細(xì)胞的正常增殖，表明小兒安神補(bǔ)腦顆粒促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用可能與其增加抗氧化酶的活性，減少脂質(zhì)的釋放相關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明氧化應(yīng)激在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。因此，基于抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)治療是一種對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病常見(jiàn)的治療方案[7]。增強(qiáng)抗氧化可以賦予機(jī)體保護(hù)作用，可以降低神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病危險(xiǎn)。其中，上調(diào)依賴(lài)于ARE信號(hào)通路的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)是提高機(jī)體防御氧化應(yīng)激的一個(gè)重要方法。

Nrf2是一種基本的亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，這種因子可以驅(qū)動(dòng)所涉及的各種基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(羥基自由基或MDA，蛋白質(zhì)等)以及氧自由基[8]。因此，轉(zhuǎn)錄激活Nrf2的細(xì)胞可能參與保護(hù)應(yīng)激所致的氧化損傷。此外，Nrf2是HO-1蛋白的和ARE通路激活的重要調(diào)節(jié)因子[9]。在正常生理環(huán)境下，Nrf2綁定到Keap1上[10]。當(dāng)氧化應(yīng)激時(shí)增加時(shí)，Nrf2從Keap1處釋放并迅速移位到核，它與ARE結(jié)合導(dǎo)致抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄的增加，激活諸如HO-1和NQO-1的抗氧化蛋白[11]。本實(shí)驗(yàn)中小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)下降的缺陷表現(xiàn)出拮抗作用，表明其作用機(jī)制可能與小兒安神補(bǔ)腦顆粒促進(jìn)Nrf2基因表達(dá)，進(jìn)而提高抗氧化蛋白表達(dá)水平，減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

總而言之，我們的研究結(jié)果表明小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用與Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活相關(guān)，這可能有助于延伸小兒安神補(bǔ)腦顆粒對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的使用。

[1]Modafferi S，Stornelli M，Chiarotti F，et al.Sleep，anxiety and psychiatric symptoms in children with Tourette syndrome and tic disorders[J].Eur J Paediatr Neurol，2016，20(5)：696-703.

[2]邱靜宇， 劉 巖.小兒安神補(bǔ)腦顆粒治療小兒多發(fā)性抽動(dòng)癥60例臨床研究 [J].中醫(yī)兒科雜志，2010，6(1)：33-36.

[3]沈自尹.從腎本質(zhì)研究到證本質(zhì)研究的思考與實(shí)踐——中西醫(yī)結(jié)合研究推動(dòng)了更高層次的中醫(yī)與西醫(yī)互補(bǔ) [J].上海中醫(yī)藥雜志，2000，34(4)：4-7.

[4]Kensler TW，Wakabayashi N， Biswal S.Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47：89-116.

[5]Brown GC，Neher JJ.Inflammatory neurodegeneration and mechanisms of microglial killing of neurons[J].Mol Neurobiol， 2010，41(2-3)：242-247.

[6]Butterfield DA，Reed T，Sultana R.Roles of 3-nitrotyrosine- and 4-hydroxynonenal-modified brain proteins in the progression and pathogenesis of Alzheimer's disease[J].Free Radic Res，2011，45(1)：59-72.

[7]Nguyen T，Sherratt PJ，Pickett CB.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2003，43：233-260.

[8]Li W，Yu SW，Kong AN.Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclear exporting signal in the Neh5 transactivation domain[J].J Biol Chem，2006，281(37)：27251-27263.

[9]van Muiswinkel FL，Kuiperij HB.The Nrf2-ARE signalling pathway： promising drug target to combat oxidative stress in neurodegenerative disorders[J].Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2005，4(3)：267-281.

[10]Calkins MJ，Johnson DA，Townsend JA，et al.The Nrf2/ARE pathway as a potential therapeutic target in neurodegenerative disease[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(3)：497-508.

[11]Itoh K，Tong KI，Yamamoto M.Molecular mechanism activating Nrf2-Keap1 pathway in regulation of adaptive response to electrophiles[J].Free Radic Biol Med，2004，36(10)：1208-1213

廣東省深圳市科技研發(fā)資金(No.JCYJ 20150401163247216)

高厚明，男，副主任中藥師。主要研究方向：中藥鑒定、中藥制劑、中藥炮制等。

廣東省深圳市中醫(yī)院(518033)