陳義鋼，顧琛，周宏，姚路斌，夏加增，瞿甦

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院，江蘇 無錫 214002）

轉(zhuǎn)移抑制基因1和微血管密度在膽囊癌中的表達(dá)及其臨床意義*

陳義鋼，顧琛，周宏，姚路斌，夏加增，瞿甦

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院，江蘇 無錫 214002）

目的 研究轉(zhuǎn)移抑制基因1（MTSS1）和微血管密度在膽囊癌中的表達(dá)，分析MTSS1和微血管密度與膽囊癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。方法利用該院已構(gòu)建成功的膽囊癌組織芯片，通過免疫組織化學(xué)方法檢測MTSS1和微血管密度在膽囊癌組織中的表達(dá)，分析MTSS1和微血管密度與膽囊癌病理參數(shù)的關(guān)系。隨防并收集患者的預(yù)后資料，通過單因素和多因素生存分析評估MTSS1和微血管密度與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果MTSS1在膽囊癌組織中的陽性表達(dá)率為44.1%（52/118）；微血管密度在膽囊癌組織中為（52.80±1.94），在正常膽囊組織中為（29.33±2.97）。低表達(dá)的MTSS1和膽囊癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)（P＜0.05），高微血管密度和腫瘤的TNM分期及肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。MTSS1的表達(dá)與微血管密度負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier和Cox生存分析表明：MTSS1和微血管密度與膽囊癌患者的總生存率相關(guān)，是膽囊癌的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論MTSS1蛋白廣泛表達(dá)于正常膽囊組織，而在癌組織中的表達(dá)率降低。低表達(dá)的MTSS1、高的微血管密度和膽囊癌的惡性生物行為有關(guān)，它們是有效的膽囊癌預(yù)后指標(biāo)。MTSS1有抑制膽囊癌進(jìn)展的作用，其抑癌作用可能與影響腫瘤微血管密度有關(guān)。但其具體功能機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

膽囊癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移抑制基因；微血管密度

膽囊癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期，目前這種惡性腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制還不完全為人們所知[1]。轉(zhuǎn)移抑制基因1（metastasis suppressor 1，MTSS1）參與調(diào)控多種腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移等惡性行為，在膀胱癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等癌組織中低表達(dá)[2-4]，但它在膽囊癌中和表達(dá)及其臨床意義還少見報(bào)導(dǎo)。微血管密度（microvessel density）也對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要作用[5-6]。本研究將檢測膽囊癌組織中MTSS1的表達(dá)和計(jì)數(shù)微血管密度，分析它們與膽囊癌重要臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，并探討MTSS1和微血管密度兩者之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

本實(shí)驗(yàn)所用的組織芯片為南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院普外科構(gòu)建與保存。該組織芯片含有118例膽囊癌患者的標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組男性患者42例，女性患者76例；中位數(shù)年齡63.7歲。具有完整的隨訪資料的患者有76例，隨訪時(shí)間最長67個(gè)月，最短1個(gè)月，中位時(shí)間18.3個(gè)月。另隨機(jī)選擇同期手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的正常膽囊組織為對照組，對照組20例，男性8例，女性12例；中位數(shù)年齡54.5歲。其中3例來自肝破裂患者，17例來自肝癌患者摘除未被侵犯的膽囊。

1.2 免疫組織化學(xué)法

1.2.1 抗體來源 MTSS1（稀釋比例1∶50；Caltag-Medsystems，英國）和CD34（稀釋比例1∶100；Dako Cytomation，丹麥）。免疫組織化學(xué)技術(shù)采用SP法（福州邁新公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）替代一抗作陰性對照組。

1.2.2 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)結(jié)果由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。MTSS1陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜。采用2級計(jì)分法，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：根據(jù)陽性細(xì)胞占＞5個(gè)高倍鏡視野比例計(jì)數(shù)，分為兩類：0%～30%為1分；＞30%為2分。染色強(qiáng)度分類：淡黃色1分；黃或深黃色為2分；褐或棕褐色為3分。兩類計(jì)分相乘＞1為陽性。

CD34免疫組織化學(xué)染色用來評估膽囊癌組織中微血管密度，染色為棕黃色的，并可與周圍結(jié)締組織、腫瘤細(xì)胞區(qū)分開來的管狀結(jié)構(gòu)為單一的、可計(jì)數(shù)的微血管。首先在低倍鏡下選擇熱點(diǎn)（微血管密度高的區(qū)域），然后選擇3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)微血管數(shù)量，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料如基因型和等位基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗(yàn)或方差分析。組間變量相關(guān)性分析用 Pearson或Spearman法處理；單因素生存曲線用Kaplan-Meier；多因素生存分析用Cox模型分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTSS1和微血管密度在膽囊癌中的表達(dá)

MTSS1主要表達(dá)于細(xì)胞漿，強(qiáng)陽性，正常膽囊黏膜不著色或呈弱陽性。MTSS1在膽囊癌組織中的陽性表達(dá)率為44.1%（52/118）；在正常膽囊組織中陽性表達(dá)為85%（17/20）（見圖1），兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。微血管密度在膽囊癌組織中為（52.80±1.94），中位數(shù)為51.13；微血管密度在正常膽囊組織中為（29.33±2.97）（見圖2），兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。

2.2 MTSS1及微血管密度在膽囊癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

MTSS1的陽性表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的不同分化程度及TNM分期相關(guān)，高微血管密度和腫瘤的不同TNM分期及有無肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

2.3 MTSS1的表達(dá)與微血管密度的相關(guān)性

為了便于統(tǒng)計(jì)MTSS1與微血管密度之間的相關(guān)性，本研究將微血管密度＞51.13（中位數(shù)）的標(biāo)本稱為高微血管密度，密度＜51.13的標(biāo)本稱為低微血管密度。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，MTSS1的表達(dá)與微血管密度之間負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.555，P=0.000）。見表2。

圖1 MTSS1在正常膽囊與膽囊癌組織中的表達(dá) （×200）

圖2 在膽囊癌與正常膽囊組織中的微血管密度 （×200）

表1 MTSS1及微血管密度與膽囊癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 MTSS1的表達(dá)和微血管密度與患者生存期的關(guān)系

納入隨防研究的患者有72例。其中男性27例（37.5%），女性45例（62.5%）。膽囊癌切除術(shù)患者的中位生存時(shí)間為7.35個(gè)月。MTSS1陽性表達(dá)患者中位無瘤生存時(shí)間為37.5個(gè)月，MTSS1陰性表達(dá)患者為5.6個(gè)月，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析提示，MTSS1的表達(dá)和微血管密度與患者總生存率有相關(guān)性（P＜0.05）（見圖3、4）。Cox回歸分析表明，肝轉(zhuǎn)移、MTSS1低表達(dá)和高微血管密度是膽囊癌的獨(dú)立預(yù)后因素（見表3）。

表2 MTSS1與微血管密度之間的相關(guān)性

圖3 Kaplan-Meier生存曲線提示MTSS1表達(dá)與膽囊癌預(yù)后相關(guān)

圖4 Kaplan-Meier生存曲線提示微血管密度與膽囊癌預(yù)后相關(guān)

表3 影響膽囊癌預(yù)后的Cox多因素回歸

3 討論

目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是涉及到多個(gè)基因、多種因素的綜合病理過程。細(xì)胞外微環(huán)境的改變、細(xì)胞內(nèi)重要結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞骨架）的功能異常都是影響腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的重要因素。LEE等[7]在研究膀胱癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因MTSS1。該研究發(fā)現(xiàn)MTSS1在轉(zhuǎn)移性膀胱癌組織中表達(dá)缺失，而能在正常膀胱組織及非轉(zhuǎn)移性膀胱癌組織中表達(dá)。后續(xù)的研究表明，在多種腫瘤組織中（如食道癌、乳腺癌、腎癌）MTSS1低表達(dá)或不表達(dá)，與其在正常組織中的表達(dá)有差異[8-9]。

但對MTSS1與腫瘤的關(guān)系還存在爭議，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)其在肝癌和結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)[8，10]。在不同的癌組織內(nèi)，MTSS1抑癌或促癌的作用也不同。因此有必要對MTSS1與人體不同部位的癌組織進(jìn)行全面研究，但目前對MTSS1與膽囊癌關(guān)系的研究還很少。本研究表明，MTSS1在膽囊癌組織中低表達(dá)，在正常膽囊組織中高表達(dá)，MTSS1的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果提示MTSS1可能是一個(gè)膽囊癌的抑癌基因。

新生血管對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，通過檢測腫瘤的微血管密度可以了解腫瘤組織的血供[11]。本研究表明，在膽囊癌組織中微血管密度較高，在正常膽囊組織中微血管密度低，微血管密度與患者預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果提示微血管密度可能是一個(gè)膽囊癌的促癌因素。

對MTSS1抑癌機(jī)制的研究表明其可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的形態(tài)與功能從而抑制腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。本研究提示MTSS1可能還對腫瘤新生血管的生成有影響。在MTSS1低表達(dá)的膽囊癌組織中，其微血管密度較高；在MTSS1高表達(dá)的膽囊癌組織中，其微血管密度較低。兩者之間負(fù)相關(guān)。

總之，MTSS1蛋白廣泛表達(dá)于正常膽囊組織，而在癌組織中的表達(dá)率降低。低表達(dá)的MTSS1、高的微血管密度和膽囊癌的惡性生物行為有關(guān)，它們是有效的膽囊癌預(yù)后指標(biāo)。MTSS1有抑制膽囊癌進(jìn)展的作用，其抑癌作用可能與影響腫瘤微血管密度有關(guān)。但其具體功能機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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（張西倩 編輯）

MTSS1 expression and m icrovessel density in gallbladder cancer and their clinical significance*

Yi-gang Chen,Chen Gu,Hong Zhou,Lu-bin Yao,Jia-zeng Xia,Su Qu
(Wuxi Second Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214002,China)

ObjectiveTo investigate the expression of MTSS1 and microvessel density in gallbladder carcinoma, and analyze the relationships of MTSS1 and microvessel density with clinicopathological parameters and prognosis.MethodsA gallbladder carcinoma tissue chip successfully-constructed in our department was used.The chip contained tissue specimens from 118 patientswith gallbladder carcinoma.The expression of MTSS1 and microvessel density in gallbladder carcinoma were detected using immunohistochemistry.The relationships of MTSS1 and microvessel density with clinicopathological parameters were analyzed.The prognosis data were collected from 72 patients.The relationships of MTSS1 expression and microvessel density with prognosis of gallbladder carcinoma were analyzed using the univariate and multivariate survival analyses.ResultsThe positive expression rate of MTSS1 in the gallbladder carcinoma tissues was 44.1%(52/118),and the microvessel density was(52.80±1.94)in the gallbladder carcinoma tissues and(29.33±2.97)in the normal gallbladder tissues.Low expression of MTSS1 was related to TNM staging,lymph metastasis and degree of differentiation of gallbladder carcinoma(P＜0.05).High microvessel density was related to TNM staging and liver metastasis of gallbladder carcinoma(P＜0.05).The expression of MTSS1 was negatively correlated with microvessel density.Kaplan-Meier and Cox survival analyses showed that MTSS1 and microvessel density were independent prognostic factors in patients with gallbladdercarcinoma.ConclusionsMTSS1 protein iswidely expressed in normal gallbladder tissues,and the expression rate is significantly lower in gallbladder cancer tissues.Low expression of MTSS1 and high microvessel density are related tomalignantbiological behaviors of gallbladder carcinoma.They are effective indexes for the prognosis of gallbladder cancer.MTSS1 can inhibit the progression of gallbladder cancer and its tumor-suppressive effectmay be related to the influence of tumormicrovessel density.But its specificmechanism remains to be further studied.

gallbladder carcinoma;metastasis;MTSS1;microvessel density

R 604；R 735.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.010

1005-8982（2017）07-0046-04

2016-12-07

江蘇省衛(wèi)生廳科研立項(xiàng)（No：H201347）

瞿甦，E-mail：361865671@qq.com；Tel：13506187399