施蕊++王娟+葉敏+趙能++夏箐++李彪

摘要：為研究滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性，先從滇重樓塊莖中分離得到98株內(nèi)生真菌，對峙試驗結(jié)果表明，其中有8株內(nèi)生真菌對供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用；內(nèi)生真菌發(fā)酵液初提物抑菌試驗結(jié)果表明，3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的提取物對供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43、PPC-78，其他菌株的發(fā)酵液提取物對供試植物病原菌沒有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：滇重樓內(nèi)生菌；分離；發(fā)酵液提取物；抑菌活性

中圖分類號： S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0086-02

滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnansensis （Franch.） Hand]分布于云南省、貴州省和四川省，生長在海拔 1 400～3 100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡內(nèi)。滇重樓根莖入藥，有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于疔腫癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等癥狀[1]。另外，滇重樓的次生代謝產(chǎn)物甾體皂苷有止血、祛痰、抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗早孕殺精子、抗細胞毒素等作用，臨床上用于治療功能性子宮出血、神經(jīng)性皮炎、外科炎癥以及腫瘤等，具有顯著的療效[2-6]。隨著新藥的研究開發(fā)，滇重樓成為著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊等產(chǎn)品的主要原料，制藥工業(yè)需求量逐年遞增，滇重樓供不應(yīng)求[7]。由于滇重樓種子有“二次休眠”現(xiàn)象，種苗繁育存在巨大困難[8]。目前滇重樓的繁殖方法主要是根莖切塊繁殖和組織培養(yǎng)等，但是在育苗過程中創(chuàng)口和組培苗容易受到病原菌侵染，導(dǎo)致滇重樓根腐病大面積發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失。植物內(nèi)生菌在植物抵御外來有害病菌入侵、促進種子萌發(fā)、促進植物生長和植物有效成分代謝等方面起著重要的作用[9-13]。但是，有關(guān)滇重樓內(nèi)生真菌的研究不多。

因此，研究滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性，有利于提高植物的抗病性；同時，研究結(jié)果能為共生真菌與植物的共生關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，為滇重樓的人工栽培提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1滇重樓塊莖來源滇重樓塊莖于2014年采自云南省普洱市。

1.1.2培養(yǎng)基試驗用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3供試病原菌供試病原菌由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室提供，供試病原菌株編號及名稱見表1，采用的病原菌均為植物土傳病害病菌。

1煙草黑脛病菌（Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker）

1.2試驗方法

1.2.1滇重樓內(nèi)生菌分離取健康滇重樓植株的根狀莖，棄泥土，用水沖洗干凈，晾干水分，按照以下步驟進行表面殺菌處理：0.2%氯化汞消毒10～30 s，無菌水沖洗，75%乙醇消毒 10～60 s，無菌水沖洗，處理完畢后在無菌條件下將滇重樓樣品切成2 cm×2 cm的小塊，種植于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)5～10 d，觀察培養(yǎng)基中有無菌落形成，挑取菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面培養(yǎng)基中，按常規(guī)微生物學(xué)法分離、純化和保藏。

1.2.2對峙試驗滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性測定采用平皿對峙培養(yǎng)法，各供試病原菌和滇重樓內(nèi)生真菌置于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，用打孔器（直徑6 mm）沿其菌落邊緣打菌餅，將內(nèi)生真菌與病原菌菌餅接種于PDA平板上距中心 15 mm 處同一直線上的2點中，同時以只接病原菌和內(nèi)生真菌的平板作為對照，每個處理重復(fù)3次，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)，每24 h觀察1次，選擇能夠抑制供試植物病原菌菌絲生長的內(nèi)生菌進行液體培養(yǎng)，準備其發(fā)酵代謝物的抑菌活性研究。

1.2.3發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的萃取將選擇的有抑菌活性的內(nèi)生菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、220 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)基中布滿菌絲，停止培養(yǎng)，挑去菌絲，用等量乙酸乙酯萃取10 h，65 ℃減壓蒸餾濃縮至2 mL，自然揮干稱質(zhì)量，加乙酸乙酯2 mL保存。

1.2.4萃取物抑菌試驗利用1/10 000天平稱量內(nèi)生菌發(fā)酵液粗提物，用無菌水將各溶劑萃取物分別稀釋成15、10、5 mg/mL 的溶液。配制馬鈴薯培養(yǎng)基，滅菌，備用。無菌條件下，將稀釋的不同發(fā)酵液粗提物與馬鈴薯培養(yǎng)基在（40±5） ℃ 條件下以1 ∶9的比例混合，倒入培養(yǎng)皿，冷卻制成有毒培養(yǎng)基平板后分別接入供試病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、煙草黑脛病菌菌餅（直徑9 mm），每個濃度、每個菌種均設(shè)3皿重復(fù)。以不加提取物的馬鈴薯培養(yǎng)基為對照。觀察菌落生長情況，在第7天測量菌落直徑，抑菌率按照公式（1）進行計算：

抑菌率=對照病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑1對照病原菌菌落直徑×100%。（1）

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1滇重樓內(nèi)生真菌和對峙試驗結(jié)果

從滇重樓植物中分離得到98株內(nèi)生真菌，將這些內(nèi)生真菌與供試植物病原菌進行對峙試驗。由表2可見，滇重樓內(nèi)生真菌PPC-78和PPC-43對供試植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有很強的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC-78對尖孢鐮刀菌的抑制率達到了100.00%；內(nèi)生菌PPC-25的抑菌效果也很好，對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌的抑制率在58.83%～7281%之間；內(nèi)生真菌PPC-03、PPC-21、PPC-32、PPC-71和PPC-73對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌也有不同程度的抑制效果。

2.2發(fā)酵液對立枯絲核菌的抑菌活性

采用對峙試驗中能夠抑制病原真菌生長的菌株發(fā)酵液初提物對立枯絲核病菌進行抑制試驗。

由表3可以看出，對峙試驗有抑菌效果的8株滇重樓內(nèi)生菌中，發(fā)酵液提取物對供試植物病原菌有抑菌作用的菌株僅有3株，它們分別是PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他

內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物對供試病原菌沒有抑制作用；PPC-25、PPC-43、PPC-78發(fā)酵液提取物對立枯絲核菌的抑菌率分別是9.76%、37.21%、67.44%，對尖孢鐮刀菌的抑菌率分別是8.65%、62.55%、83.11%，對煙草黑脛病菌的抑菌率分別是5.07%、47.66%、77.49%。相比而言，PPC-78發(fā)酵液提取物的抑菌活性最強，PPC-43次之，PPC-25最弱。其他菌株的發(fā)酵液初提物對供試植物菌株沒有抑制作用，但是活體對峙試驗有抑制作用，可能的原因有2點：（1）營養(yǎng)競爭；（2）植物病原菌刺激內(nèi)生真菌產(chǎn)生有抑菌活性的物質(zhì)。

3結(jié)論與討論

從滇重樓塊莖中分離得到98株內(nèi)生真菌，對峙試驗結(jié)果表明，其中有8株內(nèi)生真菌對供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用，菌株編號分別為PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73、PPC-78；內(nèi)生真菌發(fā)酵液初提物抑菌試驗表明，3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的提取物對供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他菌株的發(fā)酵液提取物對供試植物病原菌沒有抑制活性。

所用的植物病原菌僅包括土傳病害菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌，不能斷定除菌株P(guān)PC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73和PPC-78外的內(nèi)生菌沒有抑菌活性，應(yīng)繼續(xù)探索滇重樓內(nèi)生真菌對其他病原菌的抑菌活性，包括植物病原菌和動物病原菌。

本研究僅對部分菌株的發(fā)酵液提取物抑菌活性進行研究，還應(yīng)對其他菌株的發(fā)酵液提取物的抑菌活性進行研究；另外，本研究僅采用乙酸乙酯對發(fā)酵液中的物質(zhì)進行初步提取。下一步研究將圍繞內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定等方面進行。

參考文獻：

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典 [M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：183.

[2]李恒. 重樓屬植物[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998.

[3]張曉潔，查嶺生，陳小靜，等. 一株產(chǎn)重樓皂苷內(nèi)生細菌的分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報，2006，33（5）：84-89.

[4]武珊珊，高文遠，段宏泉，等. 重樓化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2004，35（3）：344-347.

[5]左予桐. 云南重樓抗腫瘤活性成分研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2005.

[6]劉翔. 中藥重樓皂苷的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物轉(zhuǎn)化的研究[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2009.

[7]任安芝，高玉葆. 植物內(nèi)生真菌一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物[J ]. 微生物學(xué)通報，2001，28（6）：90-93.

[8]王麗萍，趙學(xué)偉. 云南重樓野生馴化及栽培技術(shù)研究初探[J]. 中國野生植物資源，2002，21（1）：62.

[9]牛燕芬，李揚蘋，羅富成，等. 植物內(nèi)生真菌對寄主生長及抗逆性的增效機理研究進展[J]. 草原與草坪，2015，35（2）：91-96.

[10]Kumar D，Schatz F，Moore R M，et al. The effects of thrombin and cytokines upon the biomechanics and remodeling of isolated amnion membrane in vitro[J]. Placenta，2011，32（3）：206-213.

[11]Mei C，F(xiàn)linn B S. The use of beneficial microbial endophytes for plant biomass and stress tolerance improvement[J]. Recent Patents Biotechnol，2010，4（1）：81-95.

[12]馬敏芝，南志標. 黑麥草內(nèi)生真菌對植物病原真菌生長的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2011，28（6）：962-968.

[13]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內(nèi)生細菌及其對入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：9-12.漆艷香，張賀，蒲金基，等. 芒果細菌性黑斑病病菌rep-PCR遺傳多樣性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：88-91.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.022