常征++王蓉+李洪潮+張鐵++劉偉+沈清清+李付惠

摘要：以三七根腐病菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）為指示菌，采用含毒介質(zhì)法和平板對峙法，從三七根際和根圍土壤中分離篩選三七根腐病菌拮抗菌。結(jié)果表明，得到17株對三七根腐病菌具有較好拮抗效果的菌株，它們對指示菌菌絲生長的抑制率均大于50.00%，其中編號(hào)為YS（r）-19的菌株抑菌效果最明顯，抑菌率為86.40%；選取6種三七根腐病菌測定其抑菌譜，結(jié)果顯示YS（r）-19對三七根腐病菌具有廣譜抗菌性，對選取的6種病原真菌抑菌率在 35.33%～86.40% 之間。通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定，確定該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

關(guān)鍵詞：三七根腐??；生物防治；拮抗菌；分離篩選；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S432.4+4；S435.672文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0092-04

三七[Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen]，別稱金不換、田七等，為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax Linn.）植物，其干燥根和根莖，是我國特有的名貴中藥材，在我國明代張四維的《醫(yī)門秘旨》、異遠(yuǎn)真人的《跌損妙方》中均有關(guān)于三七藥用價(jià)值的正式文字記載，提到三七具有散瘀止血、消腫定痛之功效[1]。三七主要成分包括皂苷，非皂苷成分中的氨基酸與蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、炔、醇、揮發(fā)油、微量元素等[2]。藥理作用主要體現(xiàn)在對血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面的影響[3-4]。目前三七被廣泛應(yīng)用于跌打損傷、高血壓、腦血管后遺癥、冠心病、心絞痛等疾病的治療中[5-6]。

近年來，由于三七無可替代的藥用價(jià)值，使其用量和種植面積不斷增加，三七特殊的生境及耕作方式造成其土壤環(huán)境微生態(tài)失衡[7]。以根腐病為主的土傳病害是導(dǎo)致三七連作障礙的重要因素之一，長期以來阻礙著三七種植業(yè)的發(fā)展，至今仍未得到有效的解決[8]。

三七根腐病病狀表現(xiàn)為地上部黃萎或青枯，三七根部腐爛，呈濕腐和干腐2型，發(fā)病地塊病株率為5%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)70%，損失占各種三七病害的70%～85%[9]。三七根腐病致病機(jī)制目前還不清晰，報(bào)道的病原菌包括真菌、細(xì)菌和線蟲，具有多樣性，但以真菌為主，主要包括藨草鐮刀菌（Fusarium scirpi）[10]、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）[11-12]、人參鏈格孢菌（Alternaria panax）[13]、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[14]、串珠鐮孢中間變種（Fusarium moniliforme var. intermedium）[14]、雙孢柱孢（Cylindrocarpon didynum）[15]、惡疫霉（Phytophthora cactorum）[15]、草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）[15]等。

目前，三七根腐病以化學(xué)防治為主，其生物防治處于研究探索階段?；瘜W(xué)防治病原菌易產(chǎn)生抗藥性，藥劑殘留會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品安全等問題。生物防治符合環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，是未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要植保措施。眾多研究表明，使用生防菌劑可有效防治植物病害，而分離篩選高效生防菌株是開發(fā)生防菌劑的基礎(chǔ)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從云南省文山市三七基地土壤中分離的3株芽孢桿菌（Bacillus sp.）對三七根腐病病原菌壞損（毀滅）柱孢（Cylindrocarpon destructans）具有明顯的抑制作用[16]。從三七根際土壤中分離到棘孢木霉（Trichoderma asperellum）對三七黑斑病菌（Alternaria panax）、炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和根腐病菌均有較強(qiáng)的抑菌活性[17]；三七內(nèi)生真菌中存在對三七根腐病主要病原真菌具有良好抑制作用的菌種[18]。本研究以三七根腐病菌為指示菌，從種植三七的土壤中分離篩選出對三七根腐病菌有較好拮抗作用的菌株，并對其抑菌活性和抗菌譜進(jìn)行研究，以期為三七根腐病生防制劑的開發(fā)提供菌種資源并形成理論支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品2014年7月13日從云南省文山州文山市硯山縣分別選取1個(gè)三七園，采集園內(nèi)病區(qū)和健康地塊三七植株根際和根圍土壤，共計(jì)4個(gè)樣點(diǎn)，樣品為5點(diǎn)混合樣，采集后置于無菌封口袋內(nèi)封口，于冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2供試植物病原真菌病原菌：尖孢鐮刀菌、藨草鐮孢菌、人參鏈格孢菌、壞損（毀滅）柱孢菌、腐皮鐮刀菌、雙孢柱孢菌。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌株分離采用稀釋平板法分離菌株[19]。分別稱取各土壤樣品10 g，加入盛有100 mL無菌水的500 mL三角瓶中，搖床振蕩10 min，制成土壤懸液，逐級(jí)吸取1 mL樣品懸液加到9 mL無菌水中。依次按照10倍法稀釋，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度土壤懸液，渦旋振蕩 1 min，分別吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μL，涂布于含 50 mg/L 重鉻酸鉀和50 mg/L制霉菌素的高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基以及LB培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次。將涂布好的高氏1號(hào)和馬丁平板置于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h、LB平板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，挑取培養(yǎng)特征相異的單菌落，經(jīng)培養(yǎng)純化后作為供試菌。分離得到的菌株經(jīng)多次劃線純化并鏡檢后，轉(zhuǎn)接到斜面上，4 ℃保存，每隔2個(gè)月活化1次。

1.2.2拮抗菌株篩選采用含毒介質(zhì)法[20]篩選三七根腐病菌拮抗菌。將PDA培養(yǎng)基加熱融化冷卻至45 ℃左右，加入適量腐皮鐮刀菌孢子懸液，混勻，調(diào)整孢子濃度至 106 CFU/mL，制板備用。將供試細(xì)菌在37 ℃下活化培養(yǎng) 24 h，真菌在28 ℃下活化72 h后點(diǎn)接于病原菌平板上，28 ℃培養(yǎng) 48 h，觀察并測量抑菌圈，挑選抑菌效果較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3抑菌譜測定采用平板對峙法[21]測定拮抗菌對供試6種三七根腐病菌的抑菌效果及抑菌譜。在PDA平板中間接1個(gè)直徑為5 mm的供試三七根腐病菌菌餅，將初篩得到的拮抗菌株對稱點(diǎn)接在平板邊緣距指示菌菌餅25 mm處，每皿接4點(diǎn)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以只接種病原菌的平板為對照，28 ℃ 培養(yǎng)。待對照平板長滿菌絲后測量抑菌帶寬度。

1.2.4菌株分類鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[22]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]對待鑒定菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特性進(jìn)行測定。菌株16S rDNA序列測定及比對分析選用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系見表1。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。雙向測通拼接后，進(jìn)行BLAST相似序列檢索，選取相似性較高菌株的模式菌株為參比對象，采用MEGA 5.0軟件鄰接（Neighboue-Joining，簡稱NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1和Excel 2010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，用單因素方差分析各處理平均值的差異，用Duncans新復(fù)極差法比較各處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株分離及篩選

從采集的土壤樣品中，經(jīng)平板涂布分離并劃線純化，共得到332株菌株，其中227株分離自根際土壤，105株分離自根圍土壤，分別占總菌株數(shù)的68.37%、31.63%。通過鏡檢，結(jié)合菌落形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，分離到的菌株中，309株為細(xì)菌、23株為真菌。采用含毒介質(zhì)法進(jìn)行初篩，平板對峙法進(jìn)行復(fù)篩，最終得到17株對三七根腐病菌拮抗活性較好的細(xì)菌，對三七根腐病菌抑菌率均大于50%，其中13株分離自根際土壤，4株分離自根圍土壤，分別占76.47%、23.53%。其中，硯山病區(qū)土壤中的菌株YS（r）-19抑菌效果最顯著，抑菌率為8640%，并且傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性好（表2）。

2.2菌株YS（r）-19抑菌譜測定

菌株YS（r）-19對供試6種三七根腐病菌均有不同程度的抑制作用，其中對腐皮鐮刀菌作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)到了8640%，對其余5種供試三七根腐病病原菌也有很強(qiáng)的抑菌效果，抑菌率在35.33%～72.13%之間，由此表明，菌株YS（r）-19對三七根腐病菌具有廣譜抑菌活性（表3）。

2.3菌株YS（r）-19的鑒定

2.3.1形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征在LB固體培養(yǎng)基上，菌株YS（r）-19生長良好，菌落呈乳白色，菌落表面褶皺粗糙，邊緣呈鋸齒狀，菌落形態(tài)不規(guī)則。1 000倍電鏡下，菌株YS（r）-19呈桿狀，單個(gè)細(xì)胞大小為（0.5～0.6）μm×（2.0～2.5）μm，周生鞭毛，橢圓芽孢中生（圖1）。結(jié)合該菌株生理形態(tài)特征及生化特征（表4），初步將菌株YS（r）-19歸為芽孢桿菌屬。

菌株YS（r）-19經(jīng)16S rDNA測序，獲得片段長度為 1 459 bp 的部分基因序列， 在NCBI數(shù)據(jù)庫上的比對結(jié)果表明，該菌株與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）的相似性達(dá)99%以上，結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性，推測該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。選擇序列相關(guān)性較高的58個(gè)16S rDNA序列，用Cluxtal X序列軟件分析該菌株相應(yīng)序列與YS（r）-19的序列同源可靠性，選擇13個(gè)可信度較

高的序列，用MEGA 5.0軟件通過N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌模式菌株位于同一分支，且相似度達(dá)到99.9%（圖2），確定YS（r）-19的進(jìn)化地位，鑒定該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

本研究從三七植株根際土壤和根圍土壤中分離三七根腐病菌拮抗菌。根際土是作物根系周圍受根系分泌物影響的土壤，與根圍土相比，由于根系分泌物的影響，根際的微環(huán)境中存在大量活性很高的微生物種群[24]。通過分離篩選，得到17株對三七根腐病菌具有較好拮抗活性的細(xì)菌，自然存在于根際環(huán)境中的很多微生物對病原菌的生存或侵染都有影響[25]，篩選出來的活性菌株中，76.47%的菌株來自三七根際土壤，表明三七根際微生態(tài)中存在大量可開發(fā)的資源。

最終鑒定菌株YS（r）-19為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。生防菌在根部定殖能力的強(qiáng)弱決定著生防的成功與失敗，芽孢桿菌對環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在植物和土壤微生物群落中具有很大的優(yōu)勢，作為植物病害生防細(xì)菌開發(fā)具有很大潛力，其中部分性狀優(yōu)良的拮抗菌株已成功地運(yùn)用于植物病害生物防治[26]。菌株YS（r）-19分離自三七根際土壤，它在三七根際土壤內(nèi)應(yīng)具有較好的定殖能力。首次分離到甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是在2009年，由Madhaiyan等從田間水稻根際土壤中分離出[27]，隨后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對水稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv oryzae）[28]、細(xì)菌條斑病菌（Xanthomonas oryzae）[28]、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）[29]、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）[30]、灰霉病菌（Botrytis cinerea nicoti-anae）[31]、番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）[29]、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）[32]、黃瓜炭疽病（Colletotrichum orbiculare）[33]等均有很好的抑制效果，它對三七根腐病防治的研究未見報(bào)道。

目前三七根腐病的生物防治還處于起步階段，本研究篩選出的菌株YS（r）-19用于開發(fā)三七根腐病生防菌劑潛力巨大，但如何讓該菌株在三七根際有效定殖，在微生態(tài)中形成優(yōu)勢種群并發(fā)揮抗病作用及其培養(yǎng)和發(fā)酵條件等還有待深入研究。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.024