劉 珊，羅義輝

(重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331)

利用基于單鏈抗體的BIAcore技術(shù)檢測蔬菜中的殺螟硫磷殘留

劉 珊，羅義輝*

(重慶科技學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331)

為建立一種基于單鏈抗體的蔬菜中殺螟硫磷殘留快速檢測方法，測定了前期通過核糖體展示所獲得的抗殺螟硫磷單鏈抗體的親和力和特異性，并建立了基于該抗體和BIAcore X系統(tǒng)檢測蔬菜樣品中殺螟硫磷的方法。結(jié)果表明，獲得3株高親和力單鏈抗體，其與殺螟硫磷的解離平衡常數(shù)分別為4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10mol/L，與除對硫磷外的其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率<0.1%(與對硫磷的交叉反應(yīng)率≤2.8%)，說明獲得的單鏈抗體對殺螟硫磷具有很高的特異性。樣本添加回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的平均回收率介于95.8%～102.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤2.13%，說明該試驗(yàn)方法可靠，可用于實(shí)際蔬菜樣品中殺螟硫磷的快速檢測。

殺螟硫磷； 有機(jī)磷檢測； 單鏈抗體； BIAcore

有機(jī)磷農(nóng)藥因能有效控制害蟲生長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。殺螟硫磷屬于毒性中等的有機(jī)磷殺蟲劑，是常用的有機(jī)磷農(nóng)藥之一。農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留引起的中毒事件時(shí)有發(fā)生，由于蔬菜生長周期較短，而有機(jī)磷分解需要一定的時(shí)間，蔬菜中有機(jī)磷的殘留更加引起人們關(guān)注。目前，人們一般采用氣相色譜或高效液相色譜等儀器分析法對蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，但這些方法均需要復(fù)雜的前處理，因而耗時(shí)較多，對蔬菜等需要保鮮的農(nóng)產(chǎn)品不太適合[1]?；诳乖?抗體特異反應(yīng)的免疫分析由于具有靈敏、快速等特點(diǎn)，成為近年來農(nóng)殘檢測的研究熱點(diǎn)。

免疫分析的核心是高親和力、高特異性抗體的獲得?？贵w通常分為多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體，單鏈抗體(ScFv)是重組抗體之一。由于單鏈抗體具有組織穿透力強(qiáng)、生產(chǎn)成本較低等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[2]。目前也有一些抗有機(jī)磷單鏈抗體的研究[3-5]?；诒砻娴入x子共振(surface plasmare sonance，SPR)的BIAcore技術(shù)因其具有實(shí)時(shí)監(jiān)測動態(tài)反應(yīng)過程、無需對分子進(jìn)行標(biāo)記、樣本用量少、易于自動檢測、快速等優(yōu)點(diǎn)，在分析測定核酸、蛋白質(zhì)等大分子方面顯示出了巨大的應(yīng)用潛力[6-7]，近年來有較多應(yīng)用BIAcore或SPR技術(shù)檢測生物大分子的報(bào)道[7-11]。但尚無關(guān)于BIAcore檢測農(nóng)殘的報(bào)道。為此，基于前期通過核糖體展示技術(shù)篩選獲得的殺螟硫磷單鏈抗體和BIAcore技術(shù)，建立蔬菜中殺螟硫磷殘留的快速檢測方法，為蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

儀器與試劑：BIAcore X系統(tǒng)、CM5芯片、HEPES緩沖溶液(GE公司)，Model 550酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，HisLinkTM蛋白純化系統(tǒng)、卵清白蛋白(OVA)(Promega公司)，殺螟硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。

蔬菜樣品：普通蔬菜樣品(重慶市沙坪壩陳家灣菜市)、未使用農(nóng)藥蔬菜(重慶新陸農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司有機(jī)蔬菜基地)。

1.2 單鏈抗體的再篩選

單鏈抗體的表達(dá)：將前期經(jīng)過核糖體展示篩選所獲得的殺螟硫磷ScFv基因[5]與載體pPOW3.0連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 進(jìn)行小量表達(dá)。

單鏈抗體的再篩選：將篩選抗原殺螟硫磷-OVA與芯片CM5偶聯(lián)后固定于BIAcore X,分別將ScFv表達(dá)所得到的蛋白質(zhì)溶液(未純化)注射入BIAcore X,記錄單鏈抗體與殺螟硫磷的結(jié)合與解離過程，篩選獲得高親和力的抗體基因。

1.3 單鏈抗體親和力分析

單鏈抗體蛋白的純化：應(yīng)用HislinkTM蛋白純化系統(tǒng)將上一步結(jié)合-解離過程所得到的具有較強(qiáng)結(jié)合力的單鏈抗體蛋白進(jìn)行純化。

單鏈抗體親和力分析: 用HEPES緩沖溶液將純化后的單鏈抗體蛋白稀釋，得到不同濃度梯度(8、4、2、1 nmol/L)的溶液，再將溶液分別注入BIAcore X，記錄其與固定在芯片上的篩選抗原的結(jié)合-解離過程，用儀器自帶軟件分析單鏈抗體與殺螟硫磷的親和力。

1.4 單鏈抗體特異性分析

用競爭酶聯(lián)免疫分析測定上步篩選得到的高親和力抗體與殺螟硫磷及其他有機(jī)磷農(nóng)藥的結(jié)合情況，分析抗體的特異性。

酶聯(lián)免疫分析: 向酶聯(lián)板每孔中加入100 μL質(zhì)量濃度為20 μg/mL的單鏈抗體溶液(用磷酸鹽緩沖溶液配制)，做3個(gè)平行，過夜放置。次日棄溶液，用洗滌液(含0.05% Tween 20 的磷酸鹽緩沖液)洗板。用1%明膠于37 ℃封閉2 h，洗板。每孔加入不同濃度梯度的有機(jī)磷農(nóng)藥(殺螟硫磷、樂果、對硫磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、馬拉硫磷、三唑磷)50 μL，37 ℃放置1 h，再加入50 μL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的殺螟硫磷-OVA，37 ℃放置1 h，洗板。加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗OVA抗體，37 ℃放置2 h，洗板。加入底物顯色5～15 min，用硫酸終止，酶標(biāo)儀讀取OD450。

IC50(半抑制濃度)的獲得：以有機(jī)磷農(nóng)藥濃度為橫坐標(biāo)、結(jié)合率(B/B0，B是對應(yīng)濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的OD450，B0是不加有機(jī)磷農(nóng)藥的OD450)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得不同有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50。

交叉反應(yīng)率的計(jì)算：利用不同有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50計(jì)算交叉反應(yīng)率，計(jì)算公式如下。

1.5 蔬菜中殺螟硫磷的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別用磷酸鹽緩沖溶液配制單鏈抗體濃度為10 nmol/L且含不同質(zhì)量濃度梯度 (0、2、4、6、8、10 ng/mL) 殺螟硫磷的溶液，室溫下放置2 h，使抗體與殺螟硫磷充分結(jié)合，再分別注入BIAcore X，流經(jīng)表面有殺螟硫磷-OVA的CM5芯片，讀取響應(yīng)值(response unit，RU)，做3個(gè)平行，根據(jù)質(zhì)量濃度和RU值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蔬菜中殺螟硫磷的測定：將從菜市購買的番茄、黃瓜、大白菜搗碎，分別稱取20 g，加入40 mL丙酮，振蕩30 min，離心分離，取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用100 mL的磷酸鹽緩沖液溶解，取該溶液2 mL與48 mL含單鏈抗體的溶液混合，放置2 h，采用與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測定RU值，做3個(gè)平行。

1.6 樣本添加回收率試驗(yàn)

從重慶市有機(jī)蔬菜基地采摘未使用過農(nóng)藥的蔬菜樣品(番茄、黃瓜、大白菜)，添加一定量(0.20、2.0、20 mg/kg)的殺螟硫磷，進(jìn)行樣本添加回收率試驗(yàn)，各做5個(gè)平行，測定平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單鏈抗體的再篩選

作為對比，分別從經(jīng)過和未經(jīng)過核糖體展示篩選的單鏈抗體文庫中隨機(jī)挑取9個(gè)克隆子，經(jīng)大腸桿菌DH5α 表達(dá)抗體蛋白(均未純化)后逐一注射進(jìn)BIAcore X，觀察抗體蛋白是否與篩選抗原殺螟硫磷-OVA結(jié)合，所得結(jié)果如圖1所示。從單鏈抗體原始文庫隨機(jī)挑選的9個(gè)抗體蛋白幾乎不與殺螟硫磷-OVA結(jié)合(圖1A)，而從經(jīng)過核糖體展示篩選后的文庫中隨機(jī)挑選的9個(gè)蛋白有3個(gè)與殺螟硫磷-OVA有較強(qiáng)的結(jié)合，1個(gè)有較弱的結(jié)合(圖1B)。

A.原始文庫；B.核糖體展示篩選后的文庫；

2.2 高親和力單鏈抗體的篩選

利用上述方法從190個(gè)抗體基因中篩選到10個(gè)親和力較高的基因，再將這10個(gè)基因所表達(dá)的抗體蛋白純化，利用BIAcore X系統(tǒng)分析不同濃度梯度的抗體蛋白與篩選抗原的結(jié)合-解離過程(圖2)。

圖2 抗體蛋白梯度稀釋后與抗原的結(jié)合情況

通過BIAcore X擬合結(jié)合-解離曲線獲得抗體蛋白與篩選抗原的解離平衡常數(shù)，解離平衡常數(shù)越小，說明抗體與抗原親和力越強(qiáng)。據(jù)此，獲得了3株高親和力抗體ScFv-AF50、ScFv-AF93 和ScFv-AF132，解離平衡常數(shù)分別為4.56×10-10、1.42×10-9、2.66×10-10mol/L(表1)。

表1 3株抗體蛋白與抗原的作用常數(shù)

2.3 單鏈抗體的特異性

利用競爭ELISA測定了3株高親和力抗體的選擇性，分別利用結(jié)合率(B/B0)—濃度曲線獲得殺螟硫磷及其他6種有機(jī)磷農(nóng)藥對3株抗體蛋白的IC50，再利用這些有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50計(jì)算交叉反應(yīng)率(表2)。從表2可以看出，3株抗體蛋白與對硫磷的交叉反應(yīng)率稍大(≤2.8%)，與其他5種有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率都小于0.1%，說明所獲得的抗體蛋白對殺螟硫磷具有很高的特異性?？贵w蛋白與對硫磷的交叉反應(yīng)率稍大，可能是由于對硫磷與殺螟硫磷結(jié)構(gòu)相似，后者僅比前者多1個(gè)甲基(表2)。

表2 單鏈抗體蛋白與有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率 %

續(xù)表2 單鏈抗體蛋白與有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率 %

2.4 蔬菜中的殺螟硫磷殘留量測定

選擇結(jié)合力最強(qiáng)的ScFv-AF132抗體測定蔬菜中的殺螟硫磷。以不含殺螟硫磷的RU值與不同質(zhì)量濃度下RU值之差RU為縱坐標(biāo)，殺螟硫磷質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。

圖3 殺螟硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 蔬菜中殺螟硫磷含量

從表3可以看出，3種蔬菜中均有一定的殺螟硫磷殘留，大白菜中的含量最高，但都低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014對上述3種蔬菜中殺螟硫磷最大殘留量的規(guī)定(0.5 mg/kg)[12]。

2.5 樣品添加回收率

分別向番茄、黃瓜、大白菜3種蔬菜中添加0.20、2.0、20 mg/kg的殺螟硫磷，進(jìn)行方法的回收率和精密度檢驗(yàn)，測定結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，不同蔬菜中殺螟硫磷的平均回收率介于95.8%～102.2%，RSD≤2.13%，說明試驗(yàn)方法可靠，可用于實(shí)際蔬菜樣品中殺螟硫磷的快速檢測。

3 結(jié)論與討論

本研究將前期通過核糖體展示篩選獲得的抗殺螟硫磷單鏈抗體基因進(jìn)行表達(dá)，并對抗體蛋白進(jìn)行純化，利用BIAcore技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析研究了抗體的親和力和特異性，初步建立了利用基于該單鏈抗體的BIAcore技術(shù)快速檢測蔬菜中殺螟硫磷的方法。目前，國內(nèi)對有機(jī)磷類農(nóng)殘的快速檢測方法通常是酶抑制法，其優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便，但也有靈敏度不高的缺點(diǎn)，有時(shí)會造成漏檢，因?yàn)槊敢种品z測的有效范圍與農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)屬同一數(shù)量級(mg/kg)[13]。而免疫分析法檢測的有效范圍與氣相色譜法相同，均可達(dá)μg/kg數(shù)量級，本研究所建立的殺螟硫磷檢測方法將免疫分析法與BIAcore技術(shù)相結(jié)合，使之比通常的免疫分析法(如酶聯(lián)免疫分析)更精確、更快速。利用該方法篩選獲得的單鏈抗體對殺螟硫磷的解離平衡常數(shù)最小值為2.66×10-10mol/L，而以前的研究者通過噬菌體展示所獲得的抗甲胺磷單鏈抗體的解離平衡常數(shù)最小值為1.24×10-8mol/L[14]，說明本研究所獲得的單鏈抗體具有更高的親和力。樣本添加回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的平均回收率介于95.8%～102.2%，RSD≤2.13%，表明本研究的試驗(yàn)方法可靠，可用于實(shí)際蔬菜樣品中殺螟硫磷的快速檢測。然而，該方法還存在單鏈抗體需低溫保存、BIAcore不適合蔬菜的田間分析等缺點(diǎn)，在進(jìn)一步的研究中需要加以克服。

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Detection of Residual Fenitrothion in Vegetable Samples by BIAcore Based on Single Chain Antibody

LIU Shan，LUO Yihui*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Chongqing University of Science and Technology,Chongqing 401331,China)

For establishing a method to fast measure residual fenitrothion in vegetables based on single chain antibody,the affinity and specificity of single chain variable fragments(ScFvs) against fenitrothion selected by ribosome display in our preliminary study were tested,and then a method for detection of residual fenitrothion in real vegetable samples by BIAcore X system based on the ScFvs was established.The results showed that three ScFvs of high affinity were obtained,the equilibrium dissociation constants with fenitrothion were 4.56×10-10，1.42×10-9，2.66×10-10mol/L,respectively,and the cross-reactivity with other organophosphorus pesticides was below 0.1% except for parathion-methyl(≤2.8%),which indicated that the ScFvs had a high specificity for fenitrothion.Recoveries of fenitrothion from fortified vegetables were in the range of 95.8%—102.2% and the relative standard deviation(RSD) was below 2.13%.The results above indicated that this method was reliable,and could be used for fast measuring residual fenitrothion in real vegetable samples.

fenitrothion; detection of organophosphorus; single chain antibody; BIAcore

2016-10-31

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(2012104003)

劉 珊(1996-),女，重慶人，在讀本科生，研究方向：化學(xué)品分析檢測。E-mail：1218881597@qq.com

*通訊作者：羅義輝(1966-)，男，四川武勝人，講師，博士，主要從事有害化學(xué)品快速檢測研究。 E-mail：383 620 115@qq.com

S481+.8

A

1004-3268(2017)05-0095-05