用于SRAP分析的大豆DNA快速提取方法

王 芳，李領(lǐng)川，周延清

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044；2.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

用于SRAP分析的大豆DNA快速提取方法

王 芳1，李領(lǐng)川1，周延清2

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044；2.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

以大豆干種子為實驗材料，采用改良的CTAB法對大豆DNA進行提取，用瓊脂糖電泳進行檢測，并用聚丙烯凝膠電泳進行SRAP分子標(biāo)記的PCR擴增。實驗結(jié)果表明，該方法提取的NDA條帶清晰，質(zhì)量好，適用于SRAP分子標(biāo)記的PCR擴增，為進行大豆SRAP遺傳多樣性的研究奠定了基礎(chǔ)。

大豆；SRAP；DNA提取

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))的分子標(biāo)記技術(shù)因為其相對簡便快捷的特點，目前已經(jīng)被廣泛用于基因組DNA的分析，從而大大促進了遺傳育種、遺傳進化、種質(zhì)資源分類和基因克隆、基因定位等方面的研究發(fā)展。2001年美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros[1]博士提出了一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)——相關(guān)序列擴增多態(tài)性SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)，它是針對基因外顯子GC含量豐富而啟動子、內(nèi)含子AT含量豐富的特點來設(shè)計引物對ORFs(Openreading Frames)進行擴增，具有簡便、中等產(chǎn)量、高共顯性、重復(fù)性、易于分離條帶及測序等優(yōu)點。近年來，SRAP分子標(biāo)記也得到了快速的發(fā)展，目前已在小麥、水稻、花生、黃瓜、西瓜、豌豆、甘薯和辣椒等植物中得到了廣泛的應(yīng)用[2-10]。

研究大豆的SRAP遺傳多樣性，首先要考慮模板DNA的提取。以往也有實驗室采用大豆干種子提取DNA，這樣節(jié)約時間和液氮費用，具有經(jīng)濟、高效等特點，但是用于SRAP分子標(biāo)記的大豆DNA的提取國內(nèi)未見報道[2]。本實驗以大豆干種子為材料提取大豆DNA，用瓊脂糖電泳檢測，并用聚丙烯凝膠電泳進行PCR擴增。結(jié)果表明，該方法提取的NDA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，適用于SRAP分子標(biāo)記的PCR擴增，為進行大豆SRAP遺傳多樣性的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為豆科(Leguminosae)大豆屬(Glycine)的30個大豆(GlycinemaxL.Merr)品種,由河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院梁鳳珍、王樹峰和周口農(nóng)業(yè)科學(xué)院苑寶軍研究員提供(見表1)。

dNTPs和TaqDNA酶：北京天根生物科技有限公司；Marker為λ DNA/Hind Ⅲ+EcorⅠ：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純，SRAP引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表2)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

DNA的提取參照李書粉[11]的方法略加改良。

(1)取1粒干燥大豆種子置研缽中, 去除種皮后迅速研成干粉，分裝于1.5 mL離心管中(加入適量PVP)。

表1 大豆品種名稱

表2 用于大豆研究中SRAP引物

(2)在1.5 mL聚丙烯離心管中加入700 μL 65℃的2×CTAB提取介質(zhì)，再加14 μL 2%的β﹣巰基乙醇，混勻，放入65℃水浴鍋中保溫40～60 min(期間翻轉(zhuǎn)1次)，拿出離心10 min(12000 rpm)使上下分層，取出水相并轉(zhuǎn)入到另一個離心管中。

(5)重復(fù)(3)的操作，可根據(jù)情況加入適量酚。

(6)在抽出后的水相中加入1/10體積10 mol/L的NaAC和2/3體積的冰冷異丙醇，-20℃下放置3 h或過夜。

(7)離心10 min(10000 rpm)，收集沉淀并在室溫下晾干。

(8)加入70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，再用無水乙醇洗滌1次(視情況每次洗前要10000 rpm離心幾分鐘)，并在室溫下晾干。

(9)根據(jù)DNA沉淀量的多少，將其溶于適量的50～100 μL滅菌雙重水中，分裝后放入-20℃冰箱中儲存或者放入4℃冰箱中隨時待用。

(10)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取得到DNA溶液，所提DNA樣品應(yīng)出現(xiàn)一條分子量遷移率等于λ DNA/EcoR I+ HindIII Ladder21 kb的清晰條帶。

1.2.2 DNA濃度、純度檢測

DNA純度的檢測：取1μL DNA溶液，加入3000μL蒸餾水，將DNA稀釋3000倍，用分光光度計檢測純度。

DNA濃度的測定：以蒸餾水作為對照實驗，測定DNA的紫外吸收值A(chǔ)260和A280，得到相應(yīng)的OD值。并使用公式(1)計算DNA濃度。

DNA濃度=OD260×50/1000×3000

(1)

式中：DNA濃度單位為ng/μL；3000為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 電泳檢測

配制濃度為0.8%瓊脂糖，在120V電壓下跑電泳。取DNA溶液8 uL，加入2 uL的溴酚藍混合點樣，以Lambda DNA/HindIII Marker為分子量標(biāo)準，電泳結(jié)果在多功能紫外透射反射儀下觀察并照相，檢測所提DNA的大小和完整性。將質(zhì)量好的DNA溶液稀釋為50 ng/uL的工作液，并保存在-20℃冰箱中備用。

1.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系

參考Li和Quiros的SRAP擴增程序，稍加修改進行優(yōu)化實驗，建立反應(yīng)體系。反應(yīng)體系總體積為25 μL，每管中含有1×PCR buffer和滅菌水。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后前5個循環(huán)為94 ℃變性l min，35 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min，后35個循環(huán)僅將退火溫度升為50 ℃，最后72 ℃延伸7 min[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度、濃度檢測

由表3可以看出,大豆12個樣品的OD260/OD280值均在1.7～1.9之間，表明用該方法提取的DNA質(zhì)量好，純度高，蛋白及其他雜質(zhì)去除較為干凈。該改良方法提取DNA的濃度基本能滿足SRAP-PCR反應(yīng)要求。

表3 大豆種子DNA提取純度和濃度

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖1是用改良的CTAB法所提取DNA的瓊脂糖電泳圖譜，由該圖可以看出所提的模板DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，條帶比較完整，質(zhì)量較好，可以用于下一步的實驗分析中。

圖1 大豆基因組DNA的提取(1-5為樣品，M為分子量標(biāo)準)

2.3 PCR擴增結(jié)果

圖2、圖3是用該改良方法所提模板DNA經(jīng)SRAP-PCR擴增后，聚丙烯酰胺凝膠電泳的圖譜。從圖2、圖3中可以看出該圖譜擴增條帶較清晰，結(jié)果理想，可以很好地用于SRAP反應(yīng)體系，并為大豆遺傳多樣性的研究奠定基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

大豆干種子基因組DNA的提取受蛋白質(zhì)和酚類的影響較大，特別是大豆種子蛋白含量高達40%。因此，高質(zhì)量提取大豆DNA并不容易[12-18]。本實驗提取的DNA所用時間短，一般在2h左右就可以完成。與此同時，實驗的穩(wěn)定性強，可重復(fù)性較高，提取的DNA濃度、純度比較好，瓊脂糖電泳檢測以及聚丙烯酰胺凝膠電泳等分子實驗都得到了很好的驗證。通過該改良方法所提取的DNA，無論從純度、濃度、瓊脂糖電泳檢測，還是SRAP-PCR的擴增檢測，都證明該DNA達到了SRAP-PCR反應(yīng)的要求，可用于SRAP分子標(biāo)記的進一步研究，為今后大豆的SRAP遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 引物me12em12 SRAP的PAGE擴增圖譜(1～30為樣品編號，M為maeker)

圖3 引物me16em17 SRAP的PAGE擴增圖譜(1～30為樣品編號，M為maeker)

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(責(zé)任編輯 姚虹)

Rapid Isolation of Soybean DNA for SRAP Analysis

WANG Fang1, LI Ling-chuan1, ZHOU Yan-qing2

(1.College of Chemical and Food Engineering,Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou 450044, China;2.College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China)

A method of rapid DNA extraction from dry soybean seeds was established based on improved CTAB procedure. Agarose electrophoresis method and SRAP-PCR technology were used to test the DNA. The results showed that the DNA extracted with this method with clear and good quality，applied to SRAP-PCR, and also laid a solid foundation for the research on genetic diversity of soybean.

soybean；SRAP；DNA extraction

2017-03-08

河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目(2009B180016)

王芳(1982—)，女，河南鄭州人，碩士，鄭州工程技術(shù)學(xué)院化工食品學(xué)院實驗師，主要從事植物遺傳研究。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.02.026

S565.1

A

1008-3715(2017)02-0113-04