于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米妮古麗·阿不來孜，田可川

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆烏魯木齊 830011）

焉耆馬的DRA與DQA基因遺傳多態(tài)性及其序列分析

于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米妮古麗·阿不來孜，田可川*

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆烏魯木齊 830011）

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）方法檢測焉耆馬ELA-DRA*exon2、ELADQA*exon2的基因型，并對不同等位基因進(jìn)行測序，對其核苷酸與氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：焉耆馬的ELA-DRA*exon2共檢出4個(gè)等位基因；ELA-DQA*exon2共檢出9個(gè)等位基因，通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)為新等位基因。ELA-DRA*exon2、ELA-DQA*exon2的各等位基因序列分析結(jié)果表明，發(fā)生非同義替換的多態(tài)位點(diǎn)均主要分布在抗原結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)的編碼序列中。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，焉耆馬的ELA-DRA*exon2多態(tài)信息含量為0.4，屬于中度多態(tài)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明，焉耆馬在該ELA-DRA*exon2位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡（χ2＞χ20.05)。本研究為馬的抗病育種提供了理論基礎(chǔ)。

焉耆馬；主要組織相容性復(fù)合體；DRA；DQA；PCR-SSCP

主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex, MHC）廣泛分布于各種脊椎動(dòng)物體內(nèi)，是一類編碼免疫球蛋白樣受體的高度多態(tài)的基因群。MHC基因的高度多態(tài)性，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用，與物種的抗病性和易感性以及種群繁殖力和生存力密切相關(guān)[1]。通過MHC的遺傳多態(tài)性分析可以為家畜的抗病育種提供重要的理論依據(jù)。

馬的MHC又稱為馬淋巴細(xì)胞表面抗原（Equine Lymphocyte Antigen，EIA），位于第20號染色體上，由I類、Ⅱ類和Ⅲ類分子組成。其中，Ⅱ類分子在呈遞外源性抗原與免疫反應(yīng)中起到重要的作用，它包含3個(gè)DQA位點(diǎn)、2個(gè)DQB位點(diǎn)和3個(gè)DRB位點(diǎn)以及1個(gè)DRA位點(diǎn)[2]。研究表明，MHC的多態(tài)性主要集中在Ⅱ類分子的DR和DQ基因座，它們所編碼抗原功能區(qū)（抗原結(jié)合區(qū)）的第2外顯子具有多態(tài)性。前人對ELA的研究主要集中在Ⅱ類分子上，研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與馬的蚊蟲叮咬過敏癥、胃腸道與體外寄生蟲的抗性/易感性、適應(yīng)性進(jìn)化、雄性馬的睪丸素水平及精子數(shù)量、配偶選擇等具有相關(guān)性[3-9]。

焉耆馬是乘挽兼用的新疆優(yōu)良地方馬品種，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)、體格大、耐粗飼、抗熱耐寒、抗病性強(qiáng)、在不同環(huán)境條件下的適應(yīng)性和耐力性能較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）技術(shù)與測序技術(shù)，對焉耆馬的ELA-DRA*exon2與ELA-DQA*exon2的遺傳多態(tài)性進(jìn)行初步檢測分析，旨在為進(jìn)一步研究焉耆馬MHC的抗病、易感性提供理論依據(jù)，為今后馬的抗病標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用50匹焉耆馬均來自新疆巴音郭楞蒙古自治州焉耆縣。每匹馬經(jīng)頸靜脈采血10 mL，按6:1的比例加入ACD震蕩混勻，投入液氮罐帶回，-70℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 瓊脂糖、蛋白酶K、Tris飽和酚、Taq酶、dNTPs、DNA Marker:MarkerⅠ、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞、X-gal、IPTG等均購自北京天根生物技術(shù)有限公司；PBS、TE、TAE緩沖液等試劑實(shí)驗(yàn)室自備。ABI 9700 PCR儀（美國ABI公司）、DYY-Ⅲ32 型平板電泳槽（北京市六一儀器廠）、UV-1000凝膠成像系統(tǒng)（北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司）、BECKMAN ND-1000 Spectrophotometer 分光光度計(jì)（美國）、3－16K 型低溫離心機(jī)（Sigma，德國）等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，用TE進(jìn)行溶解。使用微量核酸蛋白檢測儀檢測各樣品的DNA濃度和純度并將其稀釋至80 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。引物均由由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL：10×Buffer緩沖液2.0 μL、10 mmol/L dNTP1.6 μL、上下游引物（各50 pmol/μL）各0.2 μL、Taq DNA聚合酶0.3 μL、模板DNA（80 ng）1 μL、ddH2O補(bǔ)至20 μL。

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)得到優(yōu)化后的ELA-DRA*exon2的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。ELA-DQA*exon2的擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，61.8℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的SSCP檢測 3 μLPCR產(chǎn)物與12 μL變性劑混勻形成樣品液，98℃變性5 min，立即置于冰上冷卻至上樣。變性樣品液點(diǎn)入12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠板中，4℃下140 V恒溫恒壓電壓16 h，進(jìn)行固定、氧化、銀染和顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存結(jié)果，并進(jìn)行分型，統(tǒng)計(jì)各基因型的個(gè)體數(shù)。

1.2.4 測序 根據(jù)SSCP分型結(jié)果，挑選不同的純合子進(jìn)行直接測序；選取不同的雜合子個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段快速純化回收試劑盒純化后回收，與PGM-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）TOP l0菌株，PCR鑒定后由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成測序。

1.2.5 序列分析 測序結(jié)果用Mega4軟件進(jìn)行比較，檢測核苷酸變異位點(diǎn)。利用ClustalX軟件對所有序列進(jìn)行比對，并且輔以人工校對，找出序列差異和變異位點(diǎn)。利用MEGA4對核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)SSCP分型后，統(tǒng)計(jì)每種基因型的數(shù)量，應(yīng)用PopGen32軟件計(jì)算其基因型頻率、等位基因頻率、群體雜合度（H）、有效等位基因數(shù)（Ne），利用Micrisatellite-Toolkit軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC），并檢驗(yàn)群體內(nèi)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增ELA-DRA*exon2、ELA-DQA* exon2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，無拖尾、雜帶現(xiàn)象，特異性較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR-SSCP檢測 由圖2可知，焉耆馬的ELA-DRA*exon2共檢測出了5種基因型，4個(gè)等位基因，其中A、C 2種等位基因在純合子中被檢出，B、D 2種等位基因在雜合子中被檢出。另外，焉耆馬的ELA-DQA*exon2經(jīng)PCR-SSCP檢測共檢測出11種等位基因，部分結(jié)果如圖3所示。

2.3 焉耆馬的ELA-DRA* exon2的群體遺傳學(xué)分析

2.3.1ELA-DRA*exon2的基因型頻率與基因頻率由表2可知，焉耆馬的ELA-DRA*exon2共存在AA、CC、AB、AC、AD 5種基因型，其中，AA型為焉耆馬的優(yōu)勢基因型。等位基因以A等位基因?yàn)橹?，基因頻率為0.71，B、D 2種等位基因只在雜合子中被檢出。

表1 引物序列、退火溫度及擴(kuò)增片段長度

圖1 ELA-DRA*exon2與ELA-DQA*exon2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 ELA-DRA*exon2的SSCP電泳結(jié)果

圖3 ELA-DQA*exon2的SSCP電泳結(jié)果

2.3.2 焉耆馬ELA-DRA*exon2的多態(tài)性分析 表3結(jié)果顯示，焉耆馬ELA-DRA*exon2的純合度為0.547、雜合度為0.453、多態(tài)信息含量為0.4，介于0.25～0.5之間，屬于中度多態(tài)。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，焉耆馬在該位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡

表2 ELA- DRA*exon2的基因型頻率與基因頻率

表3 ELA-DRA*exon2的遺傳多態(tài)性參數(shù)

2.3.3ELA-DRA*exon2的序列分析 將測得的4個(gè)等位基因序列與GenBank中已公布的AJ575295.1進(jìn)行比對，結(jié)果如圖4所示。共發(fā)現(xiàn)有7處突變，A等位基因在第38位和197位分別發(fā)生了C→G、T→C的突變，B等位基因在第38位、142位、191、197位分別發(fā)生了C→G、G→A、C→G、T→C的突變，C等位基因在第38位、147位、197位分別發(fā)生了C→G、G→A、T→C的突變，D等位基因在第38位、58位、98位、197位分別發(fā)生了C→G、T→A、T→C、T→C的突變。將4條核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。由圖5可知，5個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生了非同義替換，2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了同義替換。在81個(gè)氨基酸殘基中包含有21個(gè)ABS位點(diǎn)，對其進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)ABS中有4個(gè)氨基酸發(fā)生了非同義替換；而在剩余的60個(gè)non-ABS位點(diǎn)中僅有1個(gè)氨基酸發(fā)生了非同義替換。

2.4 焉耆馬的ELA-DQA*exon2各等位基因序列分析 將測得的去除上下游引物后的9個(gè)等位基因的核苷酸序列與GenBank中已公布的U92505.1序列用MEGA4進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，共存在27個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)（圖6）。將9條核苷酸序列翻譯成氨基酸序列（圖7），共有19個(gè)非同義突變，其中有11個(gè)為ABS位點(diǎn)。

圖4 焉耆馬ELA-DRA*exon2的不同等位基因的核苷酸序列比對

圖5 焉耆馬ELA-DRA*exon2不同等位基因的氨基酸序列比對

圖6 焉耆馬ELA-DQA*exon2的不同等位基因的核苷酸序列比對

圖7 ELA-DQA*exon2的等位基因氨基酸序列比對

3 討 論

近年來，對馬的DRA、DQA方面的研究報(bào)道較多，分別研究了不同馬屬動(dòng)物的ELA-DRA*exon2的多態(tài)性[8,10-12]，在馬中共發(fā)現(xiàn)了5種等位基因。將焉耆馬的4種ELA-DRA*exon2基因的測序結(jié)果與GenBank中已公布的馬的ELA-DRA*exon2等位基因的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)A、B、C、D 4種等位基因分別與已報(bào)道的DRA*0101、DRA*0301、DRA*0201及DRA*0501相同。在國內(nèi)，孟青龍[13]通過PCR-SSCP技術(shù)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接純化測序技術(shù)對7個(gè)品種馬的ELA-DRA*exon2的基因多態(tài)性進(jìn)行研究，共檢測出3種等位基因。

馬的ELA-DQA*exon2的多態(tài)性要比ELADRA*exon2高。到目前為止，已在馬屬動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了37個(gè)等位基因，其中在馬上發(fā)現(xiàn)了21個(gè)等位基因[8,12,14]。本研究在焉耆馬中共檢測出9種等位基因，將其測序結(jié)果與GenBank中已公布的馬的ELADQA*exon2等位基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的A、B、C、D、E、H等位基因分別與ELADQA*0201、ELA-DQA*0601、ELA-DQA*0801、ELA-DQA*0301、ELA-DQA*1501、ELADQA*1001相同，而F、G、I為新等位基因。孟青龍[13]通過用PCR-SSCP技術(shù)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接純化測序技術(shù)對7個(gè)品種馬的ELA-DQA*exon2位點(diǎn)的基因多態(tài)性進(jìn)行了研究，共檢測出了10種等位基因，其中，三河馬、錫尼河馬在ELA-DQA*exon2位點(diǎn)存在8種等位基因，巴爾虎馬、烏審馬存在7種等位基因，純血馬存在6種等位基因、烏珠穆沁馬存在5種等位基因。

通過以上對比可以發(fā)現(xiàn)，焉耆馬的ELADRA*exon2、ELA-DQA*exon2的多態(tài)性較前人研究的其他品種馬高[13]，可能與焉耆馬的生活環(huán)境有關(guān)。焉耆馬主要生活在高寒牧區(qū)，平均海拔在2 500～2 700 m，年平均氣溫-4.7℃，絕對最低溫度-46.6℃，四季區(qū)分不明顯，無絕對無霜期。較強(qiáng)的選擇壓力造成了焉耆馬的ELA-DRA*exon2、ELA-DQA*exon2的多態(tài)性。

將測序后的等位基因的核苷酸序列與翻譯后的氨基酸序列對照后發(fā)現(xiàn)，ELA-DRA*exon2有5個(gè)位點(diǎn)處發(fā)生了非同義替換，其中4個(gè)處于ABS位點(diǎn)；ELA-DQA*exon2共有19個(gè)非同義突變，其中有11個(gè)為ABS位點(diǎn)。表明多態(tài)位點(diǎn)的分布具有“偏向性”，即多態(tài)位點(diǎn)以及產(chǎn)生的非同義替換集中出現(xiàn)在ABS的編碼序列中。

4 結(jié) 論

焉耆馬的ELA-DRA*exon2屬于中度多態(tài)，焉耆馬在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡。通過PCR-SSCP與測序分析相結(jié)合得出焉耆馬的ELADRA*exon2、ELA-DQA*exon2均具有多態(tài)性，且ELA-DQA*exon2的多態(tài)性比ELA-DRA*exon2高；多態(tài)位點(diǎn)的分布具有“偏向性”，即多態(tài)位點(diǎn)以及產(chǎn)生的非同義替換集中出現(xiàn)在抗原結(jié)合位點(diǎn)的編碼序列中。此研究結(jié)論將為馬的抗病育種研究提供理論依據(jù)。

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Genetic Polymorphism and Sequence Analysis of DRA and DQA Gene in Yanqi Horse

YU Li-juan, ZHANG Yan-hua, XU Xin-ming, WU Wei-wei, AMINIGULI ALAIBUZI, TIAN Ke-chuan*
(Institude of Animal Science, Xinjiang Academy of Animal Sciences, Xijiang Urumqi 830011, China)

ELA-DRA*exon2 andELA-DQA*exon2 of Yanqi horse were genotyped by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) methods. Both the nucleotide sequences and the amino acid sequences of the different alleles were analyzed in these horses. The results showed four alleles ofELA-DRA*exon2 and nine alleles ofELA-DQA*exon2 were detected in 50 Yanqi horses, three new alleles were found by nucleotide sequences alignment. The estimation of the nucleotide sequences and the amino acid sequences of the different alleles in theELA-DRA*exon2 andELA-DQA*exon2 showed there was a higher ratio of non-synonymous substitutions in the antigen-binding site (ABS) region. The genetic polymorphism analysis showed that the PIC ofELA-DRA* exon2 is 0.4 in Yanqi horse, is moderately polymorphic. A Chi-square analysis suggested that the allele frequencies and genotype frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium in the Yanqi horse(χ2＞χ20.05).This paper would provide a theoretical basis for resistance breeding of horses.

Yanqi horse;MHC;DRA;DQA; PCR-SSCP

S821.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-037

2016-08-06；

2016-12-23

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KyGy2016004）；新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（XJYS1105）

于麗娟（1986-），女，新疆博州人，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳，E-mail：yljxinjiang120@ sina.com

* 通訊作者：田可川（1963-），男，博士，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail：tiankechuan@163.com