程雨+宋策+陳典+王勇

摘要：為了探索洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系小孢子敗育的時(shí)間和形式，通過(guò)石蠟切片和電鏡技術(shù)對(duì)小孢子的發(fā)育進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，在花粉母細(xì)胞時(shí)期，不育系JA花藥室壁較保持系厚且有凹凸現(xiàn)象；在四分體時(shí)期，小孢子不飽滿呈月牙狀，絨氈層與藥室壁完全脫離，細(xì)胞質(zhì)濃縮、空泡化；在小孢子發(fā)育時(shí)期，小孢子細(xì)胞質(zhì)發(fā)生濃縮、降解、嚴(yán)重空泡化，絨氈層完全解體；在成熟花粉粒時(shí)期，小孢子完全干癟聚集在一起，花藥敗育。由此推測(cè)，洋蔥不育系JA小孢子發(fā)育異常始于花粉母細(xì)胞時(shí)期，在四分體時(shí)期呈現(xiàn)出敗育，敗育的原因在于絨氈層的提早解離。

關(guān)鍵詞：洋蔥；雄性不育；性狀轉(zhuǎn)育；四分體；小孢子；敗育；細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)；絨氈層；解離

中圖分類號(hào)： S633.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0107-04

洋蔥（Allium cepa L.）為百合科蔥屬植物，別稱圓蔥、蔥頭，因其具有很好的食療保健作用和極高的藥用價(jià)值被譽(yù)為“菜中皇后”，在世界蔬菜生產(chǎn)面積上，排在馬鈴薯和番茄之后，位居第三[1]。我國(guó)是世界上洋蔥的第一大生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，產(chǎn)地主要分布在內(nèi)蒙古、甘肅、云南、山東、黑龍江等地[2]。洋蔥是最早育成并在生產(chǎn)上應(yīng)用1代雜種的蔬菜作物之一[3]。洋蔥雜種優(yōu)勢(shì)明顯，自交衰退嚴(yán)重，其1代雜種一般能增產(chǎn)20%～50%，其應(yīng)用價(jià)值已被生產(chǎn)實(shí)踐所證實(shí)[4-5]。但洋蔥為2年生異花授粉作物，其花器小，花期不集中，單花結(jié)籽率低，人工去雄成本高、難度大，因此利用雄性不育系是配制雜交種子的有效途徑[6] 。研究洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生機(jī)理對(duì)于 F1雜種的生產(chǎn)具有重要的作用。目前，洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系主要分3類，即S型、T型和近年發(fā)現(xiàn)的瓣化型，其中S型在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛[7-9]。前人對(duì)洋蔥CMS細(xì)胞學(xué)研究表明，洋蔥花藥敗育大都與絨氈層發(fā)育有關(guān)，花粉母細(xì)胞沒(méi)有異常表現(xiàn)。絨氈層的發(fā)育異常大致可歸納為3種形式：一是在四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞提前解體，不能供給小孢子生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)；二是在二分體時(shí)期，絨氈層過(guò)度肥大，而且會(huì)延遲解體，這2種類型中，絨氈層的解體總是發(fā)生在小孢子產(chǎn)生異?，F(xiàn)象之前；三是絨氈層形態(tài)完全正常，只是存在時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[10-12]。一般研究認(rèn)為，絨氈層細(xì)胞的異常死亡是造成小孢子敗育的主要原因；但也有研究表明，不育系與保持系絨氈層細(xì)胞變化不大。連高山等對(duì)某一洋蔥CMS研究發(fā)現(xiàn)，與可育系花粉母細(xì)胞相比，絨氈層細(xì)胞變化不大，但花粉母細(xì)胞次生壁和胼胝質(zhì)合成受阻，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)，有些泡狀體可相互融合，這種自噬現(xiàn)象的確與植物花藥敗育過(guò)程的細(xì)胞的敗育或者說(shuō)程序化死亡有關(guān)[13]。不同的雄性不育材料間小孢子敗育發(fā)生的時(shí)期和原因并不完全一致，掌握敗育發(fā)生的時(shí)期和成因?qū)τ谛坌圆挥霓D(zhuǎn)育和在生產(chǎn)上的應(yīng)用意義重大。本試驗(yàn)對(duì)洋蔥不育系JA及其保持系JB花粉發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察分析，從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上對(duì)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生進(jìn)行系統(tǒng)的跟蹤和比較，確定其不育發(fā)生的時(shí)期，推測(cè)不育發(fā)生的原因，從而為該不育系發(fā)生的生理學(xué)和分子生物學(xué)研究提供參考，進(jìn)而為該雄性不育性狀的轉(zhuǎn)育和利用提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

洋蔥雄性不育材料JA和保持系JB，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔥蒜課題組發(fā)現(xiàn)并選育。2013、2014年秋分別將JA和JB的種球種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站加溫溫室中，次年4月抽薹，開(kāi)花后分別采集0.8～1.0、1.8～2.0、2.7～3.0、38～4.0 mm的花蕾，冰上剝離花藥備用（經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其對(duì)應(yīng)典型發(fā)育時(shí)期為花粉母細(xì)胞時(shí)期、二分體和四分體時(shí)期、單胞花粉粒時(shí)期、成熟花粉粒時(shí)期）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不育株與可育株的形態(tài)特征在播種期到開(kāi)花期分別標(biāo)記植株編號(hào)，定期到溫室中觀察不育系與保持系的形態(tài)特征并拍照記錄。

1.2.2花藥顯微結(jié)構(gòu)在開(kāi)花盛期將采集的不同時(shí)期花藥樣本，放入FAA固定液中固定，石蠟切片法制片，切成厚 6 μm 的蠟帶，用梅氏黏貼劑粘在載玻片上，1%番紅染色，05%固綠復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3花藥超微結(jié)構(gòu)參考顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果，將不同發(fā)育時(shí)期的花藥放入2.5%戊二醛進(jìn)行前固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗，在1%四氧鋨酸固定液中固定2.5 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗，經(jīng)乙醇脫水后用1 ∶1比例的100%乙醇+100%丙酮脫水10 min，再用100%丙酮脫水10 min，固定及漂洗程序溫度均保持在4 ℃，浸透包埋后在超薄切片機(jī)上將其修成50～60 nm的小塊，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后在H-7650透射電鏡下觀察并照相。

2結(jié)果與分析

2.1不育株與可育株的形態(tài)特征

從幼苗期到開(kāi)花期，洋蔥不育株與可育株外形比較整齊一致，生長(zhǎng)勢(shì)無(wú)規(guī)律性差異，花球大小也無(wú)明顯差異，但花蕾?gòu)谋硇蜕先菀讌^(qū)分，即不育系JA花蕾雖然開(kāi)放，但花絲逐漸縮小干枯，花藥干癟無(wú)花粉，多呈墨綠色后變褐色；保持系JB花蕾外形飽滿，花絲發(fā)育正常，花藥飽滿，呈黃色（圖1）。

2.2花藥的顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1花粉母細(xì)胞時(shí)期洋蔥雄蕾原基分化發(fā)育成4個(gè)藥室（圖2-A、圖2-B），每個(gè)藥室的造孢細(xì)胞分化成若干個(gè)花粉母細(xì)胞。保持系JB花粉壁發(fā)育形狀規(guī)則，由圖2-C可以看出，花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層組成，中層細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，絨氈層細(xì)胞核染色深，核較大排列在花粉母細(xì)胞周圍。不育系JA花粉母細(xì)胞發(fā)育正常，但花粉囊細(xì)胞形狀不規(guī)則，藥室壁較保持系厚有凹凸現(xiàn)象，中層發(fā)育遲緩，花粉母細(xì)胞周圍被絨氈層細(xì)胞緊緊包圍（圖2-D）。

2.2.2四分體時(shí)期保持系JB花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)2次減數(shù)分裂形成四分體，也有未完成減數(shù)分裂的二分體存在，胞壁染色較淺，藥室表皮、內(nèi)壁發(fā)育成熟，中層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，絨氈層發(fā)育達(dá)到頂點(diǎn)，絨氈層細(xì)胞質(zhì)濃郁發(fā)達(dá)，細(xì)胞核大、染色深（圖2-E）。不育系JA花粉母細(xì)胞正常發(fā)育成四分體，但幼嫩小孢子沒(méi)有保持系飽滿，似月牙狀（圖2-F），藥室表皮、內(nèi)壁細(xì)胞膨大，比可育系厚，而中層細(xì)胞無(wú)發(fā)育跡象，細(xì)胞核染色較淺，絨氈層完全脫離藥室壁，緊緊圍繞四分體和二分體，胞質(zhì)有明顯的濃縮現(xiàn)象并空泡化。

2.2.3游離小孢子時(shí)期保持系JB花藥中包圍四分體的胼胝質(zhì)解體，釋放出小孢子，小孢子細(xì)胞核染色深清晰可見(jiàn)，絨氈層胞質(zhì)降解，但其核染色仍較深，中層細(xì)胞沒(méi)有明顯變化，表皮和藥室內(nèi)壁高度發(fā)達(dá)，藥室內(nèi)壁出現(xiàn)纖維組織，細(xì)胞核染色較深（圖2-G）。不育系JA小孢子從表面看染色透明類似泡狀，中層細(xì)胞退化，絨氈層完全退化，看不到細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)，藥室內(nèi)壁形成粗大的纖維組織（圖2-H）。

2.2.4成熟花粉粒時(shí)期保持系JB絨氈層在供應(yīng)花粉發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)后完全解離，整個(gè)花粉粒染色較深，形狀飽滿，花粉粒均勻地分散在藥室內(nèi)，相鄰花粉囊相通，藥室內(nèi)壁纖維化細(xì)胞出現(xiàn)雙核（圖2-I）。不育系JA空癟的花粉粒收縮擠在一起，粗大的纖維組織加厚，不具有開(kāi)裂腔結(jié)構(gòu)，藥室嚴(yán)重收縮變形，內(nèi)壁幾乎貼在一起，纖維層不能形成裂口，花粉囊不相通（圖2-J）。

2.3花藥的超微結(jié)構(gòu)

2.3.1四分體時(shí)期不育系JA絨氈層出現(xiàn)明顯胞質(zhì)收縮、染色質(zhì)濃縮、泡狀結(jié)構(gòu)（圖3-A ）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溢滿、線粒體膨脹（圖3-B），小孢子形狀不均勻，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)濃縮并有少量泡狀結(jié)構(gòu)（圖3-C），所以從形態(tài)上推測(cè)不育系JA絨氈層細(xì)胞在四分體時(shí)期之前就開(kāi)始了細(xì)胞編程性死亡（PCD）。保持系JB小孢子正常發(fā)育，核質(zhì)濃郁，沒(méi)有濃縮現(xiàn)象（圖3-D）。

2.3.2游離小孢子時(shí)期洋蔥游離小孢子時(shí)期，保持系JB絨氈層釋放胞質(zhì)內(nèi)容物幫助形成小孢子壁，出現(xiàn)降解現(xiàn)象（圖3-E、圖3-F），不育系JA絨氈層退化嚴(yán)重，雖然有類似小孢子壁結(jié)構(gòu)但小孢子緊密聚集在一起，細(xì)胞器無(wú)法辨別，出現(xiàn)大量泡狀結(jié)構(gòu)，不能正常發(fā)育（圖3-G）。

2.3.3成熟花粉粒時(shí)期保持系JB隨著絨氈層細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，絨氈層形成線狀，但仍有殘留（圖3-H），花粉粒逐漸成熟，電子密度濃厚，染色很深（圖3-I）。不育系JA絨氈層無(wú)法辨別，花粉壁形成，但小孢子干癟、變形，內(nèi)容物只剩殘留，完全敗育 （圖3-J）。

3討論與結(jié)論

前人研究表明，植物雄性不育小孢子敗育在不同植物材料中發(fā)生時(shí)期有所差異，相同材料不同品種間也存在差異[14-17]。本研究中不育系JA在花粉母細(xì)胞時(shí)期，小孢子花粉母細(xì)胞正常發(fā)育，藥室表皮和內(nèi)壁細(xì)胞較保持系有加厚凹凸現(xiàn)象；在四分體時(shí)期出現(xiàn)敗育跡象，小孢子不飽滿呈月牙狀，超微觀察顯示小孢子出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮現(xiàn)象，絨氈層過(guò)度肥大，出現(xiàn)液泡，藥室表皮和內(nèi)壁細(xì)胞膨大；游離小孢子時(shí)期，小孢子細(xì)胞質(zhì)濃縮加重，堆積在一起無(wú)法正常發(fā)育；成熟花粉粒時(shí)期，小孢子空癟，孢子囊皺在一起，中層和絨氈層完全退化，藥室變形不開(kāi)裂。筆者分析比較發(fā)現(xiàn)，小孢子在四分體時(shí)期出現(xiàn)敗育跡象；但是李園園等研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系63A四分體時(shí)期，四分體形成正常，而小孢子發(fā)育時(shí)期，小孢子細(xì)胞質(zhì)發(fā)生濃縮、降解，絨氈層完全解體[12]，這與杜敏霞等的研究結(jié)果[18]相似。而王瑞麗等研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系8A在花粉母細(xì)胞時(shí)期就發(fā)生了敗育[19]。小孢子敗育時(shí)期的差異可能是由材料不同造成的。

從形態(tài)學(xué)角度來(lái)看，大多數(shù)植物的小孢子敗育都涉及到了絨氈層的發(fā)育異常。絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層的特殊體細(xì)胞，與小孢子母細(xì)胞以及花藥發(fā)育后期的小孢子直接相互作用，在花粉發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，絨氈層以程序性死亡（PCD）的形式適時(shí)為小孢子發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，分泌胼胝質(zhì)酶，參與花粉粒外壁的形成，同時(shí)也為花粉的成熟提供空間。當(dāng)環(huán)境條件改變或調(diào)控絨氈層細(xì)胞 PCD 的基因發(fā)生突變時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞降解的提前或延遲，致使花粉發(fā)育受阻，并最終形成雄性不育[20-22]。王嬋等研究發(fā)現(xiàn)，大蔥不育系58A花藥絨氈層提前解體，影響了正常小孢子的形成，導(dǎo)致花粉敗育[23]。李園園等也認(rèn)為，洋蔥不育系小孢子敗育與絨氈層提前衰退有關(guān)[12]，類似結(jié)論在辣椒[24]、油菜[25]、水稻[26]等作物上均有報(bào)道。洋蔥雄性不育系JA在四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)、染色質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溢滿，線粒體膨脹等程序性死亡現(xiàn)象，而其保持系四分體時(shí)期絨氈層發(fā)育到頂點(diǎn)，但未出現(xiàn)退化現(xiàn)象，直到游離小孢子時(shí)期絨氈層才退化分解，由此推斷不育系絨氈層的提前解離是造成小孢子營(yíng)養(yǎng)不足、逐漸凋亡，最終導(dǎo)致敗育的原因之一。

形態(tài)學(xué)上的表現(xiàn)是基因表達(dá)的結(jié)果，本研究確定了洋蔥不育系JA小孢子敗育的發(fā)生時(shí)期和直接原因；但有關(guān)分子信息的研究還不明確，如哪些基因引起絨氈層提早解離，小孢子敗育除了線粒體基因的表達(dá)，與核基因是否還存在著某種關(guān)聯(lián)，洋蔥的雄性不育發(fā)生機(jī)理的研究無(wú)論是對(duì)雄性不育的利用，還是對(duì)洋蔥的雜交制種都具有重要意義，這也是下一步研究的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁毅，王永勤，于春霞，等. 中國(guó)洋蔥產(chǎn)業(yè)的回顧與展望[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（24）：308-312.

[2]高金龍，張衍榮，鄭錦榮，等. 我國(guó)洋蔥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的思考[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：282-284.

[3]王建軍，侯喜林，宋慧，等. 洋蔥育種研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)蔬菜，2003（4）：57-59.

[4]譚其猛. 蔬菜育種[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980：244-307.

[5]吳海濤，馬蓉麗，劉洪炯，等. 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2009，36（2）：297-302.

[6]李園園. 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)理研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[7]Jones H，Emsweller S. A male sterile onion[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，1936，34：582-585.

[8]Berniger. Contribution a letude dela sterility emalede loignon （Allium cepa L.）[J]. Ann Amelior Plants，1965，15：183-199.

[9]馬有會(huì)，王火旭，崔成日，等. 洋蔥瓣化型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 psf-A的遺傳分析[J]. 北方園藝，2011（6）：23-24.

[10]Holford P，Croft J，Newbury H J.Structural studies of microsporogenesisin fertile and male-sterilr onions（Allium care L.） containing the CMS-Scytoplasm[J]. Theoretical and Applied Genetics，1991，82：745-755.

[11]Patil J A，Jadhav A S，Rane M S. Male-sterility in mahrashtra onion （Allium cepa L .）[J]. Research Journal of the Mahatma Phule Agricultura University，1973，40：29-31.

[12]李園園，楊清，嚴(yán)繼勇，等. 洋蔥63A細(xì)胞質(zhì)雄性不育與絨氈層的提早衰退有關(guān)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2006，32（3）：369-372，475-476.

[13]連高山，王新宇. 洋蔥雄性不育系花藥在花粉母細(xì)胞時(shí)期的敗育與自噬現(xiàn)象緊密相關(guān)[C]//中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2013年全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集. 武漢，2013.

[14]王蘭蘭，王曉林，魏兵強(qiáng)，等. 辣椒雄性不育系及保持系小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)比較[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（1）：115-118.

[15]王開(kāi)芳，張?jiān)伱?，張金文，? 甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系105A花藥敗育的細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（13）：76-80.

[16]鄭潔，王有國(guó)，崔光芬，等. 東方百合可育品種及其不育突變體花藥形成的細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，28（3）：1246-1250.

[17]董慶華，利容千，王建波. 菜薹細(xì)胞質(zhì)不育系小抱子發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1997，24（2）：150-154.

[18]杜敏霞，劉湘萍. 洋蔥雄性不育材料小孢子發(fā)生的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（增刊3）：48-51.

[19]王瑞麗，馬蓉麗，成妍，等. 洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系小孢子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（1）：43-46.

[20]Varnier A L，Mazeyrat-Clourbeyre F，Sangwan R S，et al. Programmed cell death progressively models the development of anther sporophytic tissues from the tapetum and is triggered in pollen grains during maturation[J]. Journal of Structural Biology，2005，152（2）：118-128.

[21]張虹，梁婉琪，張大兵.花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡研究進(jìn)展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2008，26（1）：86-90.

[22] Dawson J，Wilson Z A，Aarts M G M. Microspore and pollen development in six male-sterile mutants of Arabidopsis thalian[J]. Can J Bot，1993，71：629-638.

[23]王嬋，趙泓，劉倩純，等. 大蔥CMS 58不育系及保持系花藥和花粉的顯微觀察[J]. 中國(guó)蔬菜，2014（10）：29-34.

[24]呂曉菡，方獻(xiàn)平，柴偉國(guó)，等. 辣椒胞質(zhì)不育系與保持系花藥的細(xì)胞學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2015，41（1）：44-55.

[25]魯美宏，孫萬(wàn)倉(cāng)，孔德晶，等. 白菜型冬油菜不育系LRCMS花器生理生化特性及其雄蕊發(fā)育特征研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（3）：509-515.

[26]魏磊. 紫稻型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻櫻香不育系的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)（英文版），2015，3（3）：459-461.