時(shí)昌立 秦德華 丁廣成 李朋朋 田 碧

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤治療中心，河南 鄭州 450052)

miR-517a-3p對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制

時(shí)昌立 秦德華 丁廣成 李朋朋 田 碧

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤治療中心，河南 鄭州 450052)

目的 探討miR-517a-3p對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制。方法 肺鱗癌細(xì)胞株H460培養(yǎng)24 h后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，分為miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組，并設(shè)空白對(duì)照組。CCK8檢測(cè)3組細(xì)胞的增殖情況；Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達(dá)水平。構(gòu)建e2f6-3′Utr區(qū)的雙熒光素酶報(bào)告載體，檢測(cè)miR-517a-3p對(duì)下游靶基因e2f6的調(diào)控作用。結(jié)果 CCK8檢測(cè)顯示，miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖速度較空白對(duì)照組明顯降低，miR-517a-3p 表達(dá)抑制組增殖率明顯提升(P<0.05)。miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組H460穿膜數(shù)明顯低于空白對(duì)照組；miR-517a-3p 表達(dá)抑制組穿膜數(shù)明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組，miR-517a-3p 表達(dá)抑制組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。過(guò)表達(dá)miR-517a-3p可明顯下調(diào)e2f6-3′Utr的報(bào)告載體熒光素酶活性，抑制miR-517a-3p表達(dá)后可上調(diào)熒光素酶活性，與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過(guò)表達(dá)miR-517a-3p后e2f6的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組；抑制miR-517a-3p表達(dá)后，e2f6的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 miR-517a-3p可通過(guò)調(diào)控下游靶基因e2f6而抑制肺鱗癌細(xì)胞株H460的生長(zhǎng)和侵襲力。

miR-517a-3p；肺鱗癌

肺鱗癌約占肺癌總數(shù)的40%，且多為老年患者，發(fā)病率近10年呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)〔1〕。miRNA在真核生物細(xì)胞活動(dòng)及多種腫瘤發(fā)展中具有調(diào)控作用〔2〕。相關(guān)研究顯示，miR-517a-3p可通過(guò)靶向作用于Wee1基因抑制腎癌細(xì)胞遷徙和侵襲力〔3〕，提示具有抑癌基因的作用。目前，miR-517a-3p對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在探討miR-517a-3p對(duì)人肺鱗癌細(xì)胞株H460生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H460購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、optimem培養(yǎng)基購(gòu)于上海索萊寶生物科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體、miR-517a-3p minics、miR-517a-3p inhibitor購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒、PCR擴(kuò)增引物購(gòu)于上海信裕生物技術(shù)有限公司；Transwell培養(yǎng)板、膽囊收縮素8(CCK8)試劑、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 H460放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按1×106個(gè)/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染，分為miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組，并設(shè)空白對(duì)照組。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR和CCK8檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后Trizol法提取H460細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系30 μl，反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；60℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。CCK8檢測(cè)：將轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，按1∶1比例每孔加入200 μl的DMEM培養(yǎng)基，37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，讀取495 nm處的吸光度值。

1.2.3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲力 將鋪有基質(zhì)膠的Transwell培養(yǎng)板37℃預(yù)熱，消化細(xì)胞用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗，細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/孔，接種到上室，300 μl/孔；下室中加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，孵育24 h，取出Transwell培養(yǎng)板，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，4%甲醛溶液固定20 min，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

1.2.4 Western印跡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期H460細(xì)胞，1×106個(gè)/孔密度接種到培養(yǎng)皿中，分別轉(zhuǎn)染miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組，48 h后裂解細(xì)胞提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉3 h，滴加一抗，4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，PBS洗滌后滴加二抗，室溫下孵育3 h，化學(xué)發(fā)光法顯示，凝膠系統(tǒng)采集圖像。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建MriGlo/e2f6-3′Utr和PmirGlo/e2f6-3′Utr mut報(bào)告載體，使用基因轉(zhuǎn)染試劑分別與miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組、空白對(duì)照組共轉(zhuǎn)染到H460細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，分別記為實(shí)驗(yàn)組(A1)、熒光素酶表達(dá)載體(A2)，計(jì)算A1/A2為相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-517a-3p對(duì)肺癌細(xì)胞株H460增殖能力的影響 miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p表達(dá)抑制組中miR-517a-3p表達(dá)量分別為(13.61±2.35)、(2.39±0.52)，與空白對(duì)照組(7.19±1.07)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況顯示，miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組、空白對(duì)照組吸光度值分別為(47.36±8.02)、(162.39±25.61)、(105.18±11.89)，miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖速度較空白對(duì)照組明顯降低，miR-517a-3p 表達(dá)抑制組增殖率明顯提升(P<0.05)。

2.2 miR-517a-3p對(duì)H460侵襲力的影響 miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組H460穿膜數(shù)為(46.68±7.35)，明顯低于空白對(duì)照組的(118.50±13.28)；miR-517a-3p 表達(dá)抑制組為(143.92±15.30)，明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Transwell檢測(cè)miR-517a-3p對(duì)H460 侵襲力的影響(×200)

2.3 miR-517a-3p對(duì)H460侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 miR-517a-3p過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p表達(dá)抑制組、空白對(duì)照組MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(4.369±0.525)、(10.284±1.136)、(7.390±0.954)；MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(2.920±0.374)、(7.367±0.952)、(5.312±0.628)。miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組，miR-517a-3p 表達(dá)抑制組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-517a-3p對(duì)H460細(xì)胞MMP-2和 MMP-9蛋白表達(dá)影響

2.4 miR-517a-3p對(duì)e2f6靶序列的作用 miR-517a-3p 過(guò)表達(dá)組、miR-517a-3p 表達(dá)抑制組、空白對(duì)照組野生型e2f6-3′Utr的報(bào)告載體熒光素酶活性分別為(0.541±0.036)、(1.695±0.428)、(1.059±0.495)。過(guò)表達(dá)miR-517a-3p可明顯下調(diào)e2f6-3′Utr的報(bào)告載體熒光素酶活性，抑制miR-517a-3p表達(dá)后可上調(diào)熒光素酶活性，與空白對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 miR-517a-3p調(diào)控H460細(xì)胞中e2f6的表達(dá)情況 空白對(duì)照組H460細(xì)胞中e2f6的表達(dá)量為(4.914±0.751)，過(guò)表達(dá)miR-517a-3p后e2f6的表達(dá)量為(1.957±0.136)，明顯低于空白對(duì)照組；抑制miR-517a-3p表達(dá)后，e2f6的表達(dá)量為(7.602±0.665)，明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-517a-3p調(diào)控H460細(xì)胞中e2f6的表達(dá)

3 討 論

miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且多定位在基因組中癌癥相關(guān)的位點(diǎn)，近年來(lái)多項(xiàng)相關(guān)研究證實(shí)miRNA異常表達(dá)與肺鱗狀上皮細(xì)胞癌有明顯關(guān)聯(lián)，如miR138可通過(guò)影響PDK信號(hào)通路來(lái)抑制肺鱗癌細(xì)胞的增殖、分化〔4〕；miR143、miR21的表達(dá)水平與肺鱗狀上皮細(xì)胞癌患者病理特征和治療預(yù)后明顯相關(guān)〔5〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-517a-3p在多種惡性腫瘤組織中存在異常表達(dá)，且發(fā)揮不同作用，如miR-517a-3p可通過(guò)降低細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶(CHK)1表達(dá)水平可抑制宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，有效預(yù)測(cè)宮頸癌的治療預(yù)后〔6〕；miR-517a-3p還與前列腺癌、胰腺癌等多種癌細(xì)胞侵襲有關(guān)〔7〕。

本研究說(shuō)明肺鱗癌組織中miR-517a-3p發(fā)揮抑癌基因的作用；同時(shí)細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-517a-3p可有效抑制人肺鱗癌細(xì)胞的侵襲力。相關(guān)研究顯示，e2f6可有效抑制DNA功能缺損導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，其在宮頸鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能與宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)〔8〕。本次研究顯示，miR-517a-3p的表達(dá)與e2f6呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步對(duì)e2f6蛋白表達(dá)檢測(cè)顯示，miR-517a-3p負(fù)向調(diào)控人肺鱗癌細(xì)胞中的e2f6蛋白表達(dá)，其具體功能和機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

時(shí)昌立(1985-)，男，在讀碩士，醫(yī)師，主要從事腫瘤治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.021