王煉詞

【摘 要】目的：研究槲皮素（Quercetin）對HepG2細(xì)胞膽固醇蓄積所致炎性反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制。方法：雙熒光素酶報告基因活性試劑盒檢測槲皮素對人NPC1L1啟動子活性的影響，熒光定量PCR檢測NPC1L1 結(jié)果：槲皮素可劑量依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性和NPC1L1 mRNA的表達(dá)；結(jié)論：槲皮素可通過抑制NPC1L1啟動子的活性下調(diào)其表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對膽固醇蓄積所致炎性反應(yīng)的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】槲皮素 NPC1L1表達(dá) 膽固醇攝取 炎癥反應(yīng)

人NPC1L1蛋白在肝臟表達(dá)豐富，位于肝細(xì)胞基底膜，負(fù)責(zé)重吸收膽汁中的游離膽固醇入肝[1]。研究還發(fā)現(xiàn)，NPC1L1是新型降脂藥物依澤替米貝（ezetimibe）的分子靶點(diǎn)， ezetimibe通過阻斷NPC1L1進(jìn)而減少小腸及肝臟對膽固醇的吸收[2]。體外和體內(nèi)研究均報道，ezetimibe可顯著改善膽固醇負(fù)荷導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)以及肝臟損傷。因此，NPC1L1成為NASH治療的一個新的候選靶點(diǎn)。

槲皮素（quercetin）是一種常見的植物雌激素，也是異黃酮類化合物的主要成份之一?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣泛的藥理作用，具有抗氧化、降血脂和抗腫瘤等效應(yīng)[3]。研究顯示槲皮素可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)的代謝，但對NASH的防治作用還不清楚?；谏鲜鰣蟮?，我們開展本實(shí)驗(yàn)探討槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響，從而對其介導(dǎo)的膽固醇負(fù)荷和炎性反應(yīng)的影響及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2來自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心（武漢，中國），人NPC1L1啟動子雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL4.17-hNPC1L1）及內(nèi)參質(zhì)粒由婁曉亞博士惠贈（中南大學(xué)林藥理研究所，長沙，中國），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購于Gibco 公司（美國），DMSO、槲皮素和水溶性膽固醇購于Sigma 公司（美國），ezetimibe購自TRC公司（加拿大），細(xì)胞增殖活力檢測試劑盒和雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒購自Promega公司（美國），Lipofectamine2000、Trizol、TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒購于Invitrogen公司（美國），逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司（日本），細(xì)胞內(nèi)總膽固醇檢測試劑盒購自普利萊公司（中國，北京）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37度含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。HepG2細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后鋪板（96孔），達(dá)到60-70%融合時用不同濃度槲皮素（2.5、5、10、20、40μM）進(jìn)行處理。

1.3 雙熒光素報告基因活性檢測

HepG2細(xì)胞消化后鋪板（24孔），達(dá)到60-70%融合時，用lipofectamine2000按照說明書轉(zhuǎn)染pGL4.17-hNPC1L1和內(nèi)參質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時后用不同濃度槲皮素（5、10、20、40μM）處理24小時，按照說明，使用Promega雙熒光素酶報告基因活力檢測試劑盒檢測其活性并分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean+SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響

我們利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測槲皮素對NPC1L1啟動子活性的影響，HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL.17-hNPC1L1質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒24小時后，不同濃度槲皮素處理（5、10、20、40μM）處理24小時，再用試劑盒檢測其活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，與DMSO組相比，槲皮素可濃度依賴性抑制NPC1L1啟動子的活性，10μM槲皮素即可顯著下調(diào)NPC1L1啟動子的活性。

2.2 槲皮素下調(diào)HepG2細(xì)胞中NPC1L1的mRNA表達(dá)水平

不同濃度（5、10、20μM）槲皮素處理HepG2細(xì)胞24小時后提取RNA進(jìn)行定量，觀察槲皮素對NPC1L1 表達(dá)水平影響。從圖2知，與DMSO組相比，槲皮素處理可劑量依賴性顯著下調(diào)NPC1L1 mRNA水平。

3 討論

近年來，隨著生活水平的改善，我國NASH的發(fā)病率逐年增高，但缺乏有效的預(yù)防和治療方法。有研究發(fā)現(xiàn)，NASH的發(fā)病與肝臟膽固醇負(fù)荷密切相關(guān)[4]。研究標(biāo)明，肝臟膽固醇的過度蓄積可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過引發(fā)線粒體損傷以及肝kuffer細(xì)胞和星狀細(xì)胞的活化，最終導(dǎo)致胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，造成肝臟的損傷[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)肝細(xì)胞NPC1L1啟動子活性，進(jìn)而下調(diào)HepG2細(xì)胞NPC1L1的表達(dá)；抑制NPC1L1介導(dǎo)的膽固醇蓄積及炎癥反應(yīng)。

人體膽固醇水平的動態(tài)平衡受到膽固醇的自身合成、小腸對膽固醇的吸收以及膽汁膽固醇的分泌三條途徑的嚴(yán)格控制。人NPC1L1蛋白是小腸和肝臟（重）吸收膽固醇的關(guān)鍵蛋白，因此NPC1L1表達(dá)的高低對于維持全身及肝臟膽固醇動態(tài)平衡有著重要的意義[6]。多種脂質(zhì)代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與了NPC1L1的表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP2和PPARα可與NPC1L1啟動子區(qū)域特異性序列結(jié)合，說明兩者可通過直接結(jié)合NPC1L1啟動子上調(diào)其表達(dá)[7]。已有報道，槲皮素可通過抑制多種轉(zhuǎn)錄因子如SREBP-1c及PPARα的表達(dá)減少脂質(zhì)的生成[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制NPC1L1啟動子活性進(jìn)而下調(diào)肝細(xì)胞中NPC1L1的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過PPARα途徑進(jìn)行調(diào)控。

參考文獻(xiàn)：

[1] Charlton MR， Burns JM， Pedersen RA， sing RA.et al. Frequency and outcomes of liver transplantation for nonalcoholic steatohepatitis in the United States [J]. Gastroenterology， 2011；141：1249-53.