賈會玲　黃曉德　錢驊　朱羽堯　陳斌　韓雙雙　趙伯濤

摘要[目的]研究9種植物精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病的抑菌活性。[方法]采用濾紙片法和試管梯度稀釋法測定了9種精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病的抑菌活性。[結(jié)果]與陽性對照福美雙相比，異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油對黃瓜枯萎病的抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別達(dá)（32.0±0.3）和（20.4±0.2）mm。異硫氰酸丙烯酯對黃瓜枯萎病的最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MFC）均為0.049 μL/mL，肉桂精油對黃瓜枯萎病菌的MIC和MFC均為0.098 μL/mL，其余精油及精油單體的抑菌效果較弱。[結(jié)論]異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油對黃瓜枯萎病的抑菌活性較好，具有進(jìn)一步研究的價值。

關(guān)鍵詞植物精油；精油單體成分；黃瓜枯萎??；抑菌活性

中圖分類號S436.421.1+3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0160-03

Abstract[Objective] The antifungal activity of nine essential oils and essential oil monomers was tested against Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum. [Method] The antifungal activity of nine essential oils and essential oil monomers was studied by using filter paperresearch and broth dilution method. [Result] The inhibition zone of allyl isothiocyanate and cinnamon essential oil on Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum were （32.0±0.3） and （20.4±0.2） mm， respectively， compared with the positive control. The minimal inhibitory concentration （MIC） and the minimal fungicidal concentration （MFC） on Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum of the allyl isothiocyanate were both 0049 μL/mL， and the MIC and MFC on Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum of the cinnamon oil were both 0.098 μL/mL. Their antifungal effect was close to thiram. But the inhibition effects of the rest of essential oils and essential oil monomers were weaker. [Conclusion] Allyl isothiocyanate and cinnamon essential oil had better antifungal effects， which was important to further research and develop.

Key wordsEssential oil；Essential oil monomers；Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum；Antifungal activities

黃瓜枯萎病是一種嚴(yán)重的土傳病害，其病原菌為半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.cucumerinum），引起的植物枯萎病在十大植物真菌病害中排在第5位[1]，是影響黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一。病菌從幼根或傷口侵入，大量繁殖后，堵塞黃瓜木質(zhì)部導(dǎo)管，阻礙水分沿著導(dǎo)管向地上部運(yùn)輸，使植株迅速萎蔫且病勢發(fā)展迅速，很難控制。我國流行的菌系為生理小種4號[2]，常年發(fā)病率在10%～30%，重病年份在80%～90%[3]，使黃瓜大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了黃瓜生產(chǎn)。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用多菌靈、惡霉靈、代森錳鋅等殺菌劑來防治黃瓜枯萎病。但化學(xué)農(nóng)藥的防治易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，所以采用安全、高效、環(huán)境友好型生物防治成為最佳選擇。

植物精油是一類植物源次生代謝物質(zhì)，其分子量較小，可隨水蒸氣蒸出并且具有一定揮發(fā)性的油狀液體[4]，具有殺菌、防腐、殺蟲等生物活性。有關(guān)植物精油、精油單體成分抑制植物病原菌的研究很多[5-10]。因植物精油及精油單體成分來源于天然，在環(huán)境中可以被完全降解，不會產(chǎn)生殘留，對人體相對安全，是一種環(huán)境友好型殺菌成分。其用途十分廣泛，具有廣闊的開發(fā)前景。筆者主要以黃瓜枯萎病菌為供試菌，對植物精油及精油單體成分的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，以期為植物精油及精油單體成分在農(nóng)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試精油及精油單體成分。丁香精油、孜然精油、牛至精油由南京野生植物綜合利用研究院植物資源與化學(xué)研究室通過蒸餾提取獲得；肉桂精油購自于宏芳香料（昆山）有限公司；98%異硫氰酸丙烯酯、100%丁香酚、95%枯茗醛、95%香芹酚和100%百里香酚購自于廣州漢佰斯日化科技發(fā)展有限公司。

1.1.2供試菌種。植物病原真菌：黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院郭世偉教授提供。

1.1.3培養(yǎng)基。馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然，分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃濕熱滅菌20 min。馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然，分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.1.4儀器與試劑。KDM 1 000 mL恒溫電熱器（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）、電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、IKA渦旋振蕩器（深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司）、HG75-4電熱恒溫兩用培養(yǎng)箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）、HZQ-F160全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）、50%福美雙可濕性粉劑（山東羅邦生物農(nóng)藥有限公司）和二甲基亞砜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR）。

1.2方法

1.2.1抑菌圈法（濾紙片法）測定[11-12]植物精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病原菌的抑制作用。將供試植物精油及精油單體成分用二甲基亞砜（DMSO）配制成體積濃度為50 μL/mL，稱取10 mg福美雙溶解于1 mL二甲基亞砜中，制成有效濃度為5 mg/mL的福美雙溶液備用。用無菌接種環(huán)刮取少量黃瓜枯萎病菌種于無菌馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，然后用無菌液體培養(yǎng)基制成濃度為1×106～1×107 cfu/mL的菌懸液，備用。按照無菌操作的方法，將融化的無菌馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿中待凝固后，加入100 μL菌懸液涂布均勻，一段時間后用無菌鑷子夾取已經(jīng)滅過菌的6 mm無菌圓形濾紙片，每片濾紙片滴加5 μL抑菌劑貼在固體平板上，每個培養(yǎng)皿貼3片，每組做3個平行對照，以含DMSO濾紙片的培養(yǎng)基作為空白對照，福美雙作為陽性對照，將培養(yǎng)皿放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察測量，取3組平行對照的測量值并計算抑菌圈直徑平均值，測量結(jié)果中包括濾紙片直徑（6 mm）。

1.2.2最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MFC）的測定。對于經(jīng)過濾紙片法初篩得到的具有較好抑菌活性的植物精油及精油單體成分，采用試管二倍稀釋法[13]測定其最小抑菌濃度。用DMSO將植物精油及精油單體成分稀釋成不同濃度梯度的稀釋液，每支試管分別加入100 μL 1×105～1×106 cfu/mL制備好的菌懸液，設(shè)立對照組：陰性對照組只含液體培養(yǎng)基和菌液，不含精油或精油單體成分。陽性對照組除含液體培養(yǎng)基和菌液外，每管再加入福美雙。將試管置于28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，每處理設(shè)置2個平行對照，3次重復(fù)。按照文獻(xiàn)方法[14]判定最小抑菌濃度：觀察試驗(yàn)組、對照組的渾濁情況，以判斷不同濃度的精油及精油單體成分的抑菌作用。試驗(yàn)組如試管內(nèi)呈渾濁，表明有菌生長，用“+”表示；如試管內(nèi)透明清亮，表明無菌生長，用“-”表示。試管中呈清亮透明的精油或精油單體成分的最小濃度為其最小抑菌濃度。

最小殺菌濃度的測定[15]：將0.1 mL精油或精油單體成分有效抑菌濃度藥液移至空白的馬鈴薯固體培養(yǎng)基上涂布均勻，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基上有無菌物生長，以培養(yǎng)皿中計數(shù)減少原始菌落的99.9%的精油或精油單體成分的濃度作為最小殺菌濃度。最小抑菌濃度與最小殺菌濃度可能相同，也可能不同[16]。

1.2.3數(shù)據(jù)處理。采用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS軟件中ANOVA 方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncans 新復(fù)極差法比較數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌圈測定結(jié)果

由表1可知，9種供試抑菌劑中除了枯茗醛和孜然精油外，其他精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病菌都有一定的抑菌效果。其中，異硫氰酸丙烯酯對黃瓜枯萎病的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)（32.0±0.3）mm，且抑菌圈大小顯著高于陽性對照福美雙（有效濃度為5 mg/mL，下同）；肉桂精油對黃瓜枯萎病也有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為（20.4±0.2）mm，僅次于異硫氰酸丙烯酯，抑菌作用與福美雙相當(dāng)；牛至精油、香芹酚和百里香酚對黃瓜枯萎病的抑制效果差距不大，但抑菌圈大小低于陽性對照福美雙；丁香酚與丁香精油的抑制黃瓜枯萎病的作用較差，抑菌圈直徑分別為（10.3±0.1）和（8.3±0.1）mm，抑菌效果遠(yuǎn)低于陽性對照。各抑菌劑的抑菌效果從大到小依次為異硫氰酸丙烯酯、肉桂精油、百里香酚、香芹酚、牛至精油、丁香酚、丁香精油。

2.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MFC）

通過濾紙片法初篩得到抑菌效果較好的抑菌劑，測定其MIC與MFC。由表2可知，異硫氰酸丙烯酯對黃瓜枯萎病的MIC和MFC最小，均為0.049 μL/mL。其次，肉桂精油對黃瓜枯萎病的MIC、MFC都是0.098 μL/mL，以上2種抑菌劑對測試菌種的MIC、MFC與陽性對照福美雙的MIC、MFC比較接近。其他抑菌劑的MIC、MFC較大，供試菌種的MFC為MIC的2～4倍。異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油的MIC、MFC均小于01 μL/mL，說明兩者在較低濃度下對黃瓜枯萎病菌具有較好的殺菌效果。該MIC和MFC與“2.1”的抑菌效果相一致。

3結(jié)論與討論

該研究通過測定9種精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)除了孜然精油和枯茗醛外，剩余的精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病均具有不同程度的抑菌效果。抑制黃瓜枯萎病菌作用最強(qiáng)的是異硫氰酸丙烯酯，且抑菌效果強(qiáng)于陽性對照福美雙（有效濃度5 mg/mL）。其次是肉桂精油，對黃瓜枯萎病的抑制作用較強(qiáng)，抑菌效果與福美雙相當(dāng)。其余精油及精油單體成分對黃瓜枯萎病的抑制作用較差，抑菌效果均低于福美雙。在最小抑菌濃度與最小殺菌濃度試驗(yàn)中，異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油的MIC、MFC均在0.1 μL/mL以下，其他精油及精油單體成分的MIC、MFC均大于0.1 μL/mL，進(jìn)一步表明異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油具有較強(qiáng)的抗黃瓜枯萎病原真菌的作用。異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油是天然調(diào)味料中的主要成分，是可食用的原料，開發(fā)生物農(nóng)藥，具有安全環(huán)保優(yōu)勢。

隨著對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和環(huán)境保護(hù)認(rèn)識的提高，研究利用植物精油用于植物有害生物的防治報道越來越多[17-19]。異硫氰酸丙烯酯、肉桂精油的殺菌活性已有報道：異硫氰酸丙烯酯對禾本科植物上赤霉菌等真菌具有較好的抑菌活性[10]，對6種辣椒土傳病原菌菌絲生長也均具有強(qiáng)烈的抑制作用[20]；肉桂精油對番茄莖枯病菌和蘋果青霉病菌等多種重要的果蔬病害致病真菌的菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用[21]。在該試驗(yàn)中，異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油對黃瓜枯萎病的菌絲生長具有很好的抑制作用，尤其是異硫氰酸丙烯酯具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，對黃瓜枯萎病的菌絲生長具有很強(qiáng)的抑制效果，預(yù)期如作為土壤熏蒸劑，能很好地控制由尖孢鐮刀菌黃瓜?；途纫鸬某Ｒ娡羵鞑『?。

植物精油的活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，具有酚、酸和醛、酮類成分的精油大部分都具有抑菌活性，肉桂精油中的主要成分為肉桂醛，百里香酚為百里香精油的主要成分，香芹酚主要存在于牛至精油中，而丁香酚為丁香精油的主要成分，這些精油都表現(xiàn)有較強(qiáng)的抑菌活性[22]；異硫氰酸酯類物質(zhì)分子內(nèi)擁有—NCS共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，具有活撥的化學(xué)性質(zhì)[23]。該試驗(yàn)中，異硫氰酸丙烯酯和肉桂精油對黃瓜枯萎病菌活性較強(qiáng)，推測黃瓜枯萎病菌異硫氰酸丙烯酯中的共軛雙鍵—NCS和肉桂精油中的肉桂醛對黃瓜枯萎病菌作用比較敏感，而百里香酚、香芹酚與丁香酚等酚類物質(zhì)對黃瓜枯萎病菌不敏感，因而未表現(xiàn)出很好的抗枯萎病菌活性。出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能由抑菌成分本身的結(jié)構(gòu)決定，也可能受試驗(yàn)方法的影響，具體的抑菌機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

植物精油無論是單種植物精油還是其單體成分都具有良好的抑菌活性。另外，許多植物精油具有多重生物活性，既具有殺蟲活性，也具有抑菌活性。植物精油的這些特點(diǎn)為其開發(fā)利用提供了有利條件[17]。我國的肉桂產(chǎn)量占世界肉桂產(chǎn)量的80%以上，這就為肉桂精油的開發(fā)應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)條件[24]；山葵及芥子等調(diào)味料中的異硫氰酸丙烯酯類成分可以人工合成，價格低廉?？梢?，異硫氰酸丙烯酯、肉桂精油具有較好的抗黃瓜枯萎病原菌的開發(fā)利用價值，作為農(nóng)用殺菌劑應(yīng)用具有廣闊前景[25]。

該試驗(yàn)對于黃瓜枯萎病菌的抑制作用只是著眼于對菌絲的抑制效果，有關(guān)精油及精油單體成分對其孢子萌發(fā)的影響、抑菌作用方式、在活體植物上的防病效果以及對其他植物病原菌的抑菌效果，還有待進(jìn)一步研究。另外，因植物精油及精油單體成分有很強(qiáng)的揮發(fā)性，需找到一種較好的穩(wěn)定劑作為其載體，使之制劑化，更好地應(yīng)用到農(nóng)業(yè)中，也有待于后續(xù)研究。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

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