果蔬農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)固定化酶片的制作研究

張登科 郝程列 鐘凱

摘要 [目的]對(duì)膽堿酯酶的保藏性進(jìn)行研究分析，以期得到保障農(nóng)藥殘留檢測(cè)的最佳酶活力。[方法]試驗(yàn)選定高酶活力的大豆酯酶為酶原，通過(guò)篩選最適反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、離子濃度和最適pH，及最佳的反應(yīng)顯色體系來(lái)確定反應(yīng)最適的條件，采用不同的顯色體系酶抑制法，研究酶片的制作方法。[結(jié)果]酶片載體材料采用硝酸纖維膜，制作每張酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底試管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積100 μL，4 ℃固定10 h；制作每張顯色片，需在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風(fēng)吹干，封膜真空保存。[結(jié)論] 固蘭B鹽和α-乙酸奈酯組合，適合作為酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的顯色劑，且效果明顯。

關(guān)鍵詞 大豆；膽堿酯酶；農(nóng)藥殘留；酶片

中圖分類號(hào) TS207.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0081-04

Abstract [Objective]The preservation of cholinesterase was studied in order to guarantee the best enzyme activity of pesticide residue detection. [Method] The soybean esterase with high enzyme activity was selected as zymogen， optimum reaction conditions by screening the optimal reaction temperature， reaction time， concentration and pH， reaction and the best color system were determine.The method of making enzyme tablets was studied by using different color system and enzyme inhibition method.[Result]Nitrocellulose membrane was used for enzyme piece of material， which made each enzyme take 20 μL soybean enzyme liquid， 15 μL 0.5% BSA solution， 2 μL 0.05% glutaraldehyde to the bottom of the tube.Add 0.03 mol/L pH 7.0 phosphate buffer and the total volume was 100 μL， 4 ℃ fixed 10 h.Made each color piece， should add 50 μL chromogenic agent in 1 cm×1 cm filter size， 30 μL substrates， 4 ℃ cold wind blow dry， sealing membrane vacuum preservation. [Conclusion]The combination of solid blue B salt and αnaphthyl acetate is suitable for the detection of organophosphorus pesticide residue by enzyme inhibition method， and the effect is obvious.

Key words Soybean；Cholinesterase；Pesticide residues；Enzyme slices

農(nóng)藥殘留是農(nóng)藥使用后一個(gè)時(shí)期內(nèi)未被分解而殘留于生物體、收獲物、土壤、水源、大氣中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱[1-2]。農(nóng)藥殘留檢測(cè)酶抑制法，是基于農(nóng)藥的毒性機(jī)理來(lái)進(jìn)行測(cè)定的，農(nóng)藥在生物體內(nèi)能與乙酰膽堿酯酶結(jié)合，且不易分離[3-4]，乙酰膽堿酯酶的活性受有機(jī)磷和氨基酸甲酸酯類農(nóng)藥的特異性抑制，喪失了水解底物的活力[5]，致使神經(jīng)傳導(dǎo)中的乙酰膽堿不能水解而積累，影響神經(jīng)的信號(hào)、遞質(zhì)的正常傳遞，神經(jīng)持續(xù)興奮，發(fā)生抽搐等，導(dǎo)致昆蟲(chóng)中毒甚至死亡[6]。根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)酶促反應(yīng)具有抑制作用這一毒理學(xué)特性，建立了酶抑制法檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留[7-8]。其中由于植物酯酶的成本大大低于動(dòng)物性的乙酰膽堿酯酶，且來(lái)源廣泛易得，因此植物酯酶抑制法測(cè)定農(nóng)藥殘留是一種很經(jīng)濟(jì)適用的方法[9-10]。該試驗(yàn)著重研究酶抑制法的關(guān)鍵工作酶——植物酯酶，從大豆中提取植物酯酶，將提取出來(lái)的植物膽堿酯酶固定到載體上，制作成快速檢測(cè)酶片，提高酶活力，也探究提高植物酯酶的保藏期，解決膽堿酯酶難以保存的問(wèn)題，用于農(nóng)藥殘留的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。

東北大豆，購(gòu)自天津紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；α-乙酸奈酯，天津傘科技有限責(zé)任公司；硝酸纖維膜（NC），北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白（BSA），Ruibio分裝，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙酮、戊二醛、苯，均為分析純，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠；氧樂(lè)果，天津京津農(nóng)藥廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。

JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；EX224電子天平，奧豪儀器（上海）有限公司；國(guó)華SHZ-82恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；LD5-2B低速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備。

大豆用組織搗碎機(jī)粉碎成粉末，按料液比1∶5（g∶mL）分別稱取適量的大豆粉，加入pH 7.0 濃度為0.03 mol/L的磷酸緩沖液，4 ℃浸泡12 h后振蕩30 min，以5 000 r/min離心10 min，上清液濾紙過(guò)濾得到粗酶液，冷藏備用，同時(shí)測(cè)定粗酶液酶活力。

1.2.2 大豆酯酶最適反應(yīng)條件。

1.2.2.1 最適反應(yīng)溫度。

分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下測(cè)定酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。

1.2.2.2 最適pH測(cè)定。

分別在pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的緩沖液中測(cè)定酶活力，確定最適pH。

1.2.2.3 確定緩沖液的最適離子濃度。

設(shè)定緩沖液的離子濃度分別為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045 mol/L，分別測(cè)定其酶活力，繪制曲線圖，確定其最適離子濃度。

1.2.3 酶活力的測(cè)定。

1.2.3.1 原酶液吸光度值的測(cè)定及不同用量顯色劑時(shí)溶液的顯色效果。

在試管中加入20 μL酶液和2.40 mL pH 7.0的磷酸緩沖液（對(duì)照管加2.45 mL），然后加入50 μL底物α-乙酸奈酯溶液，將試管都置于30 ℃水浴中反應(yīng)15 min，向各試管中再加入50 μL固蘭B液，放在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，立即在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度[4]。

1.2.3.2 2種顯色劑對(duì)比試驗(yàn)。

該試驗(yàn)分別采用固蘭B鹽和2，6-二氯酚靛酚鈉作顯色劑進(jìn)行效果對(duì)比，添加相同量的農(nóng)藥稀釋液，測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶抑制率，比較顯色劑的效果。

1.2.3.3 抑制率計(jì)算方法。計(jì)算公式如下：

抑制率（%）=[（△A0-△At）/△A0]×100%

式中，△A0為對(duì)照管吸光度值；△At為抑制管吸光度值。

1.2.4 農(nóng)藥氧樂(lè)果不同稀釋濃度下對(duì)酶的抑制率。

該試驗(yàn)將農(nóng)藥氧樂(lè)果分別稀釋成不同濃度，稀釋倍數(shù)分別為10、20、30、50、100、150、200、250、300、400、500、1 000，測(cè)定不同農(nóng)藥濃度下酶的吸光度變化，計(jì)算酶抑制率。

1.2.5 大豆酯酶的固定及酶片和顯色片的制作。

1.2.5.1 試驗(yàn)組①。

分別將硝酸纖維膜和濾紙剪成1 cm×1 cm的小片，放進(jìn)0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中，4 ℃浸泡48 h。一次性取40 μL大豆酶液，30 μL 0.5%的BSA溶液，4 μL 0.05%戊二醛于平底試管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積200 μL，將上述液體在漩渦混合器上混勻，取活化好的硝酸纖維膜浸入液體中，4 ℃下固定10 h。取出酶片，用pH 7.0的PBS溶液沖洗數(shù)次。4 ℃自然吹干或者用冷風(fēng)吹干，封膜真空保存。

1.2.5.2 試驗(yàn)組②。

如圖1，酶片制作流程：將濾紙剪成1 cm×1 cm大小的卡片，每片上加入20 μL酶液，20 μL底物α-乙酸奈酯丙酮溶液。

顯色片制作流程（圖1）：

顯色片有2種方案，一種采用0.8%的固蘭B溶液制作，另一種采用0.5%的2，6-二氯酚靛酚鈉制作。顯色片的制作，在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風(fēng)吹干，封膜真空保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆酯酶原酶液活力測(cè)定

由表1可知，通過(guò)浸泡提取的原酶液活性較高，吸光度值達(dá)到0.844，說(shuō)明大豆可以作為植物膽堿酯酶提取的試驗(yàn)材料。

2.2 最適反應(yīng)溫度

如圖2可知，20～65 ℃下測(cè)定酶活力，大豆酯酶的最適反應(yīng)溫度在25～40 ℃，在30 ℃酶的活力最高。

2.3 最適pH測(cè)定

圖3所示是在30 ℃溫度下，在pH 4.5～8.5范圍緩沖溶液中測(cè)定酶活力大小，大豆酯酶在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)活性最高，其活力在pH 7.5時(shí)最高。

2.4 確定緩沖液的最適離子濃度

如圖4所示，在0.010～0.045 mol/L不同離子濃度的緩沖溶液中測(cè)定酶活力，離子濃度在0.020～0.040 mol/L體系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力值在離子濃度為0.030 mol/L。

2.5 不同用量顯色劑對(duì)酶活力的影響

由圖5可知，當(dāng)顯色劑固蘭B的用量不同時(shí)，溶液的吸光度值不一樣，用量和吸光度值呈正相關(guān)，當(dāng)將顯色劑固定到白色濾紙載體上時(shí)，應(yīng)使用較高用量，或者使用較高濃度，避免白色濾紙片對(duì)顏色的掩蓋作用，使顏色分明，方便觀察。

由表2可知，僅從酶的抑制率效果來(lái)看，使用2，6-二氯酚靛酚鈉作顯色劑，酶抑制率效果非常明顯，平均抑制率326.07%，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不加酶的情況下，2，6-二氯酚靛酚鈉依然褪色，從而得出結(jié)論，2，6-二氯酚靛酚鈉不適合作有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的顯色劑。使用固蘭B作顯色劑，檢測(cè)酶抑制率效果相對(duì)較差，但是比較穩(wěn)定。綜合考慮，固蘭B鹽更適合作有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測(cè)的顯色劑。

2.6 氧樂(lè)果不同稀釋濃度下對(duì)酶的抑制率

由表3可知，酶抑制率與農(nóng)藥濃度呈正相關(guān)，農(nóng)藥稀釋濃度越大，酶抑制率越低，當(dāng)稀釋1 000倍時(shí)，酶抑制率還能達(dá)到10%左右。由此可見(jiàn)，氧樂(lè)果的藥效較強(qiáng)。

2.7 比較2種顯色片的效果

組合一見(jiàn)圖6，固蘭B、α-乙酸奈酯組合，將稀釋一定濃度后的農(nóng)藥滴加到酶片上（圖6中編號(hào)2、3），對(duì)照組滴加相同量蒸餾水（圖6中編號(hào)1），保持酶片濕潤(rùn)，將顯色片覆蓋在酶片上，稍等片刻，編號(hào)1的酶片上沒(méi)有農(nóng)藥，膽堿酯酶未受抑制，遇到顯色劑，產(chǎn)生紫紅色（由于色差，顏色更接近褐色）變化；編號(hào)2、3的酶片由于滴加了農(nóng)藥，膽堿酯酶受到抑制，顯色片不變色。根據(jù)顏色變化和顏色深淺即可初步判斷農(nóng)藥含量，農(nóng)藥含量越高，顏色越深，農(nóng)藥含量越低，顏色越淺。

組合二見(jiàn)圖7，2，6-二氯酚靛酚鈉做顯色劑，將稀釋一定濃度后的農(nóng)藥滴加到酶片上（圖7中編號(hào)2、3），對(duì)照組滴加相同量蒸餾水（圖7中編號(hào)1），保持酶片濕潤(rùn)，將顯色片覆蓋在酶片上，顯色片立即產(chǎn)生變化，編號(hào)1的酶片上沒(méi)有農(nóng)藥，膽堿酯酶未受抑制，遇到顯色劑，藍(lán)色顯色片不發(fā)生變化；編號(hào)2、3的酶片由于滴加了農(nóng)藥，顯色片的藍(lán)色立即褪色，數(shù)秒后藍(lán)色全部褪去。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不添加酶的情況下滴加農(nóng)藥藍(lán)色依然褪去，由此說(shuō)明2，6-二氯酚靛酚鈉不適合做有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的顯色劑。

2.8 酶片測(cè)試結(jié)果 如圖8所示，分別用稀釋30倍（有效成分0.013 mg/kg）的氧樂(lè)果對(duì)固蘭B酶片進(jìn)行試驗(yàn)，觀察顯色效果，可看出依然能有效抑制酶活性，酶片不發(fā)生變化。試管抑制試驗(yàn)中，農(nóng)藥稀釋1 000倍，抑制率依然達(dá)到10.3%。

3 結(jié)論

大豆酯酶作為一種廉價(jià)易得的植物酯酶，其最適反應(yīng)溫度為30 ℃，pH 7.5時(shí)酶的活性最高，緩沖液離子濃度在0.02～0.04 mol/L體系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力吸光度值為0.844。粗酶液在4 ℃和-20 ℃ 2個(gè)保藏溫度下隨著保藏天數(shù)的延長(zhǎng)，酶活力均呈下降趨勢(shì)，4 ℃保藏條件下的酶活力下降速度快于-20 ℃保藏條件，至保藏36 d時(shí)酶活力幾乎完全喪失。

酶片采用硝酸纖維膜，制作每張酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底試管中，添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積100 μL，4 ℃固定10 h；制作每張顯色片，需在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風(fēng)吹干，封膜真空保存。

固蘭B鹽和α-乙酸奈酯組合，適合作為酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的顯色劑，且效果明顯。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙建莊，梁桂芝，柴麗娜，等.乙酰膽堿酯酶分離純化的方法[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18（4）：249-251.

[2] 王松.蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測(cè)定方法的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] 涂憶江.我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24（4）：14-16.

[4] 魏福祥，王振川，王金梅.乙酰膽堿酯酶生物傳感器法測(cè)定蔬菜水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].食品科學(xué)，2007，28（2）：229-231.

[5] 黃捷，馬雙成.中藥農(nóng)藥殘留檢測(cè)中前處理方法的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J].中國(guó)藥師，2011，14（7）：1036-1039.

[6] 雷明，張?zhí)?，文建雷，?農(nóng)藥殘留檢測(cè)用植物酯酶的篩選[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008，28（1）：183-187.

[7] 劉春紅，馮志彪.以α-乙酸萘酯為底物植物酯酶活力測(cè)定條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2008，29（6）：145-147，151.

[8] 董超，史延茂，張麗萍，等.采用植物酯酶測(cè)定農(nóng)藥殘留量的研究[J].農(nóng)藥，2001，40（9）：19-20.

[9] 許娟，李建科，牛樂(lè).農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)固定化酶片的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：268-272.

[10] 田子華.酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.