劉海青 楊夢醒 姜慧

摘要 [目的]探究紅蓮型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）與不同恢復(fù)基因之間的作用模式。[方法]利用特異性引物結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)，在紅蓮型水稻近等恢復(fù)基因系L-Rf5、L-Rf6，恢復(fù)系9311和不育系粵泰A（YTA）中檢測2個(gè)包臺型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b的表達(dá)量。[結(jié)果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表達(dá)，而Rf1b只能在部分材料或部分組織中表達(dá)。對同一時(shí)期二者的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，L-Rf5和9311的相同組織中Rf1a表達(dá)水平顯著高于Rf1b，L-Rf6葉片中Rf1a的表達(dá)量則低于Rf1b。[結(jié)論]該研究結(jié)果對研究紅蓮型恢復(fù)系的遺傳多樣性具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 Rf1a；Rf1b；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；熒光定量PCR

中圖分類號 S188+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0139-03

Abstract [Objective]To investigate the mode of action of cytoplasmic male sterility （CMS） and different restorer genes in Honglian type rice. [Method]The expression of Rf1a and Rf1b of BoroII were tested by fluorescence quantitative PCR in the LRf5， LRf6， the restorer line 9311 and the sterile line YuetaiA（YTA）. [Result]Rf1a can be expressed in all of them and Rf1b can only be expressed in partial of them. The expression level of Rf1a was significantly higher than Rf1b in LRf5 and 9311， and the expression of Rf1a in LRf6 was lower than that in Rf1b. [Conclusion]The results of this study have a certain value for the study of genetic diversity of the restorer gene in HLtype.

Key words Rf1a；Rf1b；Cytoplasmic male sterility；Fluorescence quantitative PCR

水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）是重要的種質(zhì)資源。在對包臺型水稻雄性不育（BT-CMS）及其恢復(fù)機(jī)理的研究過程中發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞質(zhì)雄性不育由線粒體編碼的細(xì)胞毒素肽引起，2個(gè)含PPR蛋白基因中的任何一個(gè)均可破壞或降解細(xì)胞毒素肽使植株育性恢復(fù)，從而在分子水平解釋了包臺型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育及育性恢復(fù)性的機(jī)理[1]。在基因座Rf1處鑒定了2個(gè)含PPR蛋白的育性恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b[2]。Rf1a和Rf1b是來源于同一個(gè)基因簇中的2個(gè)成員，定位于10號染色體上。研究人員對粳稻的28 000余份cDNA克隆并測序，得到Rf1a[3]。

在對紅蓮型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育（HL-CMS）的研究過程中，克隆并鑒定了2個(gè)有關(guān)的恢復(fù)基因Rf5和Rf6。Rf5定位于10號染色體上，其編碼的RF5是一種五肽重復(fù)區(qū)（PPR）蛋白，能夠與其配對蛋白（GRP162，識別編碼162個(gè)氨基酸的富含Gly的蛋白質(zhì)）互作形成復(fù)合物RFC并結(jié)合atp6-orfH79，導(dǎo)致這個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解，從而恢復(fù)育性[4]。Rf6定位于8號染色體上，其編碼的RF6與己糖激酶6（OsHXK6）結(jié)合，并且促進(jìn)異常的CMS相關(guān)轉(zhuǎn)錄物atp6-orfH79降解，從而確保正常的花粉發(fā)育和育性恢復(fù)[5]。

比對HL-CMS的恢復(fù)基因Rf5與BT-CMS的恢復(fù)基因Rf1a的序列，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因CDS區(qū)域完全相同，并且都能編碼1個(gè)由791個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，產(chǎn)物包含有16 個(gè)三角狀五肽重復(fù)序列基序和線粒體定位信號肽。新的研究表明2個(gè)紅蓮型恢復(fù)基因Rf5和Rf6能夠恢復(fù)包臺型CMS[6]。該試驗(yàn)在紅蓮型水稻中檢測到有包臺型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b后，利用Chen等[7]開發(fā)的InDel-Rf1a標(biāo)記和Rf1b特異性引物，通過熒光定量PCR[8]的方法在紅蓮型水稻中對這2個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明Rf1a在近等基因恢復(fù)系L-Rf5、L-Rf6，恢復(fù)系9311和不育系粵泰A（YTA）中都能表達(dá)，Rf1b只能在部分材料和組織中表達(dá)，這將為紅蓮型恢復(fù)基因的遺傳模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅蓮型水稻近等基因恢復(fù)系L-Rf5、L-Rf6，恢復(fù)系9311和不育系粵泰A（YTA），所有材料均來源于中南民族大學(xué)生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 水稻總RNA提取。

分別取紅蓮型水稻近等基因恢復(fù)系L-Rf5、L-Rf6，恢復(fù)系9311和不育系粵泰A（YTA）4種水稻幼苗期葉片和莖，加液氮磨碎成粉末狀，用TriZOL法提取總RNA，并完成RNA質(zhì)量檢測。

1.2.2 cDNA的合成及檢測。

取2 μg總RNA，加入DNase I去除其中的DNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)得到cDNA。以cDNA為模板用Rf1a和Rf1b的特異性引物，采用半定量PCR將cDNA濃度調(diào)成一致。

增片段長度都為180 bp左右。擴(kuò)增體系為10 μL（H2O 6.7 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 0.8 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，rTaq 0.1 μL，cDNA模板 1 μL）；擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，28次循環(huán)；72 ℃延伸1 min。

1.2.3 熒光定量PCR。

熒光定量PCR儀器為AB 7500Fast實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。反應(yīng)體系配制須在冰上且避光；設(shè)置引物濃度為0.6 μL（10 mmol/L），模板濃度為50 ng/μL；退火溫度為58 ℃。

反應(yīng)體系：SYBR Green 7.5 μL，cDNA模板2 μL，H2O 4.3 μL，引物F 0.6 μL，引物R 0.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性3 s，58 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，40次循環(huán)；60 ℃預(yù)熱60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性15 s。在每一循環(huán)的退火階段收集熒光，實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)并且記錄熒光信號的變化，得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。以水稻actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)熒光定量的數(shù)據(jù)計(jì)算2個(gè)基因Rf1a和Rf1b在不同材料不同組織中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA和cDNA質(zhì)量檢測

采用Nanodrop2000微量分光光度計(jì)檢測提取得到的總RNA，濃度均約為2 500 ng/μL，A260/A280比值在1.90～2.00，A260/A230比值在1.90～2.20。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果顯示RNA質(zhì)量（包括濃度與純度）良好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增actin，擴(kuò)增結(jié)果顯示cDNA質(zhì)量良好且無DNA污染（圖2）。

2.2 Rf1a和Rf1b在不同組織中表達(dá)量的檢測

根據(jù)熒光定量數(shù)據(jù)計(jì)算不同材料不同組織在同一時(shí)期2個(gè)基因的相對表達(dá)量（圖3、4）。在水稻幼苗期，Rf1a在L-Rf5、L-Rf6和9311中都有表達(dá)，其中表達(dá)量最高的是在L-Rf5的葉片中，所有試驗(yàn)材料里，Rf1a在葉片中的表達(dá)量都要高于莖中的表達(dá)量；Rf1b的表達(dá)只有在L-Rf5的葉片、L-Rf6的葉片和莖中能明顯檢測到，其中L-Rf6葉片中表達(dá)量最高，其余試驗(yàn)材料中沒有明顯檢測到這個(gè)基因的表達(dá)。

2.3 Rf1a和Rf1b表達(dá)量的對比分析

通過對同一時(shí)期不同材料和組織中的Rf1a和Rf1b基因表達(dá)量的對比（圖5），在水稻幼苗時(shí)期，L-Rf5和9311的相同組織中Rf1a表達(dá)水平顯著高于Rf1b，L-Rf6的葉片中Rf1a的表達(dá)量則低于Rf1b。在L-Rf5的莖，9311、YTA的葉和莖中，Rf1b都只有很少的表達(dá)量。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

該次試驗(yàn)結(jié)果表明2個(gè)包臺型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b可以在紅蓮型水稻不育系和恢復(fù)系中表達(dá)，其表達(dá)量因材料或組織不同而不同。Rf1a在L-Rf5、L-Rf6，恢復(fù)系9311和不育系YTA中都能檢測到表達(dá)而且恢復(fù)系中的表達(dá)量顯著高于不育系。而Rf1b只能在近等基因系恢復(fù)系L-Rf5、L-Rf6中顯著表達(dá)，恢復(fù)系9311中表達(dá)量較少，不育系YTA中幾乎不表達(dá)。對同一時(shí)期二者的表達(dá)量分析，L-Rf5，9311的相同組織中Rf1a表達(dá)水平顯著高于Rf1b，L-Rf6的葉片中Rf1a的表達(dá)量則低于Rf1b。

3.2 討論

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）由線粒體基因組中的嵌合開放閱讀框引起，雄性不育可以通過核基因組中的育性恢復(fù)基因（Rf）恢復(fù)[9]。CMS/Rf系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于雜交種子生產(chǎn)，有助于闡明植物中線粒體與核基因組之間的相互作用[10]。BT-CMS是由線粒體中orf79導(dǎo)致[2]，花粉育性的恢復(fù)是通過10號染色體上育性恢復(fù)基因Rf1調(diào)控。該調(diào)節(jié)基因Rf1（包括2個(gè)等位基因，Rf1a和Rf1b）已經(jīng)被克隆并定位在Rf1位點(diǎn)[11-13]。Rf1a和Rf1b均編碼含有五肽復(fù)合物的蛋白質(zhì)。具有多個(gè)恢復(fù)基因位點(diǎn)的配子體CMS/Rf系統(tǒng)開發(fā)的F1雜交后代可以產(chǎn)生超過50%的正?；ǚ哿２⒈憩F(xiàn)出良好的結(jié)實(shí)率[14]，這可能對BT型雜交育種非常有意義[15]。

紅蓮型的2個(gè)主要恢復(fù)基因Rf5和Rf6分別定位在10號和8號染色體[4-5，14]。Rf5編碼的RF5蛋白與其配對蛋白GRP162互作形成復(fù)合物RFC并結(jié)合atp6-orfH79，導(dǎo)致這個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解，從而恢復(fù)育性[4]。Rf6編碼的RF6蛋白與己糖激酶6（OsHXK6）結(jié)合，并且促進(jìn)異常的CMS相關(guān)轉(zhuǎn)錄物atp6-orfH79降解，從而確保正常的花粉發(fā)育和育性恢復(fù)[5]。在紅蓮型水稻中，這2個(gè)基因表現(xiàn)出相似的恢復(fù)能力[14]。

已有的證據(jù)顯示，在9311內(nèi)，與BT-CMS相關(guān)的2個(gè)基因正是Rf5和Rf6[6]。BT-CMS中這2個(gè)基因的恢復(fù)能力測試結(jié)果為熱激條件下Rf6的恢復(fù)能力比Rf5更穩(wěn)定[6]。通過比對已公布的Rf1a和Rf5的序列，證實(shí)二者為同一基因。水稻育種試驗(yàn)揭示了HL-CMS與BT-CMS恢復(fù)和保持關(guān)系的相似性[16]。因此推斷2個(gè)包臺型恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b在HL-CMS中有恢復(fù)作用。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示在同一時(shí)期相同材料的相同組織中，Rf1a比Rf1b具有明顯高的表達(dá)量，一個(gè)可能的假設(shè)是這2個(gè)基因的恢復(fù)活性存在差異，恢復(fù)活性的差異是由于恢復(fù)的分子機(jī)理不同。這個(gè)假設(shè)需要更多的試驗(yàn)來證實(shí)。

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