張鴻暉+謝斌輝

[摘要]目的 研究構(gòu)建可以穩(wěn)定表達(dá)HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圓細(xì)胞株的方法。方法 采用LE培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠卵圓細(xì)胞株（LE/6），以質(zhì)粒PcDNA3.1-HBVx中的HBVx序列為模板，PCR法擴(kuò)增得到目的基因片段A。將HBx目的基因片段和質(zhì)粒載體pEGFP-Nl進(jìn)行雙酶切，線性化得到重組質(zhì)粒命名為pEGFP-HBx。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5a，并進(jìn)行篩選培養(yǎng)。用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵圓細(xì)胞，作為pEGFP-HBx組；用脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體pEGFP-Nl，作為pEGFP-NI質(zhì)粒組。最后將Pre-MicroRNA-21與HBx-LE/6共培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光表達(dá)情況。結(jié)果 pEGFP-HBx中GFP表達(dá)量經(jīng)熒光定量PCR儀器確定為92.28%，且表達(dá)程度強(qiáng)；Pre-MicroRNA-21與HBx-LE/6共培養(yǎng)完成后，pEGFP-HBx組內(nèi)MicroRNA-21的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)儀器測(cè)量為1.77±0.24，顯著高于pEGFP-NI質(zhì)粒組內(nèi)的0.36±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 本研究成功地構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HBx和MicroRNA-21基因肝卵圓細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究HBx蛋白、miRNA-21、肝卵圓細(xì)胞與肝癌之間的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]HBx；MicroRNA-21基因；肝卵圓細(xì)胞；大腸埃希菌DH5a；質(zhì)粒載體pEGFP-Nl

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（a）-0004-04

Experimental study on the construction of hepatic oval cell strain stably expressing HBx and MicroRNA-21 gene

ZHANG Hong-hui XIE Bin-hui

Department of Emergency Surgery，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College in Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To study the construction method of stably expressing HBx and MicroRNA-21 gene of hepatic oval cell strain.Methods Oval cell strain （LE/6） in rat was cultured using LE culture medium，and HBVx sequence in plasmid of PcDNA3.1-HBVx was used as the template，and target gene fragment A was obtained by PCR method amplification.HBx target gene fragment and plasmid vector pEGFP-Nl were conducted double enzyme digestion，and the recombinant plasmid obtained by linearization was named as pEGFP-HBx.Competence of Escherichia coli DH5a was transformed by recombinant plasmid to conduct screening and culture.The plasmid was transfected into oval cells by liposome method （the pEGFP-HBx group） while plasmid vector pEGFP-Nl was transfected by liposome method （the pEGFP-NI plasmid group）.Finally，Pre-MicroRNA-21 and HBx-LE/6 were given co-culture，and after 24 h culture，fluorescence expression of transfected cell was observed by fluorescence microscopy.Results The expression volume of GFP in pEGFP-HBx determined by fluorescence quantitative PCR instrument was 92.28%，with strong expression degree.After the co-culture of Pre-MicroRNA-21 and HBx-LE/6 was completed，the transcription level of MicroRNA-21 in pEGFP-HBx group measured by instrument was （1.77±0.24），and it was significantly higher than that in the pEGFP-NI plasmid group （0.36±0.21），and differences between the two groups was statistically significant （P<0.05）.Conclusion The stable expression of HBx and MicroRNA-21 gene in hepatic oval cell strain is successfully constructed，which provides the experimental basis for further study on the relationship between HBx protein，miRNA-21，hepatic oval cells and liver cancer.

[Key words]HBx；MicroRNA-21 gene；Hepatic oval cell；Escherichia coli DH5a；Plasmid vector pEGFP-Nl

乙型肝炎病毒（HBV）感染是原發(fā)性肝癌（肝癌）的重要危險(xiǎn)因素，HBV基因結(jié)構(gòu)中包括S、C、P與X 4個(gè)開放閱讀框，可起到反轉(zhuǎn)錄激活作用，激活大部分的病毒與腫瘤基因，直接作用于肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而MicroRNA屬于內(nèi)源性非編碼小RNA，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。近來有研究表明，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，而且已被證明這些腫瘤干細(xì)胞在腫瘤中發(fā)揮重要作用，而干細(xì)胞也具有腫瘤干細(xì)胞類似的特性[3-4]，這些研究結(jié)果提示，腫瘤有可能來源于腫瘤干細(xì)胞。肝卵圓細(xì)胞被認(rèn)為是人體肝內(nèi)的干細(xì)胞，其特性與腫瘤干細(xì)胞極其相似，而且有研究表明肝卵圓細(xì)胞以及HBx蛋白可成為肝癌治療和預(yù)防的靶細(xì)胞和靶基因，MicroRNA-21能夠成為新的肝癌基因治療的靶分子[5]。鑒于此，為了更好地研究腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等，我院構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圓細(xì)胞株，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

從實(shí)驗(yàn)鼠身上提取肝卵圓細(xì)胞LE/6細(xì)胞，我院科研中心構(gòu)建并保存pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒和真核表達(dá)載體pEGFP-N1。實(shí)驗(yàn)所需試劑均從國(guó)內(nèi)上海生工生物工程公司合成購買。從日本Takara公司購進(jìn)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ。我院科研中心擁有CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（英國(guó)GalaxyS）、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司）、熒光分析儀（美國(guó)Beckman公司）、低溫高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）、超低溫冰箱（青島Haier公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、雙向電泳儀（北京生化儀器廠）、核酸蛋白檢測(cè)儀（南京大學(xué)普陽科學(xué)儀器研究所）、超純水儀（Millipore公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc1000，美國(guó)BioRad公司）等一大批先進(jìn)的進(jìn)口儀器設(shè)備。

1.2研究方法

培養(yǎng)肝卵圓細(xì)胞，主要步驟如下。將大鼠卵圓細(xì)胞株（LE/6）采用用LE培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：培養(yǎng)基成分包括10%的FBS，胰島素濃度為1 μg/ml，氫化可的松濃度為0.5 μg/ml，慶大霉素濃度為25 μg/ml。再給培養(yǎng)基中加入淋巴細(xì)胞抑制因子（LIF），使最終培養(yǎng)液中LIF的濃度為1000 IU/ml；將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，要求培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%，每72小時(shí)傳代1次。利用胰蛋白酶消化細(xì)胞將培養(yǎng)基中細(xì)胞接種于6孔板中，等到細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)70%～80%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達(dá)HBx蛋白和MicroRNA-21的肝卵圓細(xì)胞株，其具體做法如下。①獲得相應(yīng)的目的基因：以質(zhì)粒PcDNA3.1-HBVx中的HBVx序列為模板，通過PCR擴(kuò)增儀篩選出目的基因片段A。根據(jù)GeneBank中HBVx序列，設(shè)計(jì)引物，并在引物下游部分分別引入限制性酶切位點(diǎn)HindⅢ和KpnⅠ。②構(gòu)建重組質(zhì)粒：建立雙酶切的反應(yīng)體系，將目的基因A和質(zhì)粒載體pEGFP-Nl進(jìn)行雙酶切，線性化得重組質(zhì)粒命名為pEGFP-HBx。③質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5a，并進(jìn)行篩選培養(yǎng)。④將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵圓細(xì)胞（pEGFP-HBx組）：按陽離子脂質(zhì)體試劑盒上的說明書制作Lipofectin/DNA混合物，方法：往250 μl無血清培養(yǎng)基（OPTI-MEM）中加入10 μg陽離子脂質(zhì)體，混勻，在常溫下放置5 min；然后往250 μl無血清培養(yǎng)基（OPTI-MEM）中投放4 μg質(zhì)粒并且混勻。接著把質(zhì)粒溶液加入陽離子脂質(zhì)體培養(yǎng)基混合溶液內(nèi)，輕輕混勻，在常溫下放置30 min，備用。用PBS清洗細(xì)胞后，將包裹好的Lipofectin/DNA加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，要求溫度37℃，CO2濃度為5%、溫育5 h后，棄去轉(zhuǎn)染液，換含血清的LE培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-NI作為pEGFP-NI質(zhì)粒組。⑤將Pre-MicroRNA-21與HBx-LE/6共培養(yǎng)。獲得的穩(wěn)定表達(dá)MicroRNA-21與HBx細(xì)胞株見圖1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組受轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)量的比較

pEGFP-HBx和pEGFP-NI質(zhì)粒在限制性內(nèi)切酶酶切后，進(jìn)行電泳后，pEGFP-HBx組中GFP表達(dá)量經(jīng)熒光定量PCR儀器確定為92.28%，表達(dá)程度強(qiáng)，pEGFP-NI組中GFP表達(dá)量在35.14%，表達(dá)程度弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。圖2為轉(zhuǎn)染pEGFP-HBx基因后，LE/6細(xì)胞形態(tài)的變化，由之前的卵圓形變?yōu)槎趟笮巍?/p>

2.2兩組受轉(zhuǎn)染細(xì)胞Pre-MicroRNA-21質(zhì)粒檢查結(jié)果的比較

Pre-MicroRNA-21與HBx-LE/6各10組共培養(yǎng)，培養(yǎng)完成經(jīng)電泳后，pEGFP-HBx組內(nèi)MicroRNA-21的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)儀器測(cè)量結(jié)果為1.77±0.24，顯著高于pEGFP-NI質(zhì)粒組內(nèi)的0.36±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.982，P<0.05）。

3討論

HBV感染是肝癌的一個(gè)主要原因，肝癌患者中有80%以上的患者都攜帶HBV。HBx是一個(gè)多功能蛋白，作為反式激活因子對(duì)HBV復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)參與細(xì)胞多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及一些信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化[6-7]，最主要的是該蛋白可對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑起正向調(diào)節(jié)作用[8]。卵圓細(xì)胞被認(rèn)為是成體肝內(nèi)的干細(xì)胞，一般見于小葉間膽管，數(shù)量極少，具有自我更新、自我增殖和多向性分化的能力，這些特性與腫瘤干細(xì)胞非常相似[9-10]。HBx蛋白是一種癌蛋白，很多學(xué)者認(rèn)為該蛋白在肝癌發(fā)病過程中有一定的作用[11]。研究表明，HBx基因在卵圓細(xì)胞中的整合率高達(dá)85%，這與其在肝硬化和肝癌組織的整合率一致，因此肝卵圓細(xì)胞以及HBx也被肝病專家認(rèn)為可以作為肝癌治療和預(yù)防的靶細(xì)胞和靶基因[12-13]。

MicroRNA-21是一種具有自主轉(zhuǎn)錄單位的miRNA，并在多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)顯著的異常表達(dá)，且參與調(diào)控多種抑癌基因的表達(dá)，提示miRNA-21作為一個(gè)致癌miRNA，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并被認(rèn)為是能夠成為新的肝癌基因治療的靶分子[14-15]。

在本研究中，通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圓細(xì)胞株，pEGFP-HBx和pEGFP-NI質(zhì)粒在限制性內(nèi)切酶酶切后，pEGFP-HBx中GFP表達(dá)量經(jīng)熒光定量PCR儀器確定為92.28%，且表達(dá)程度強(qiáng)，顯著優(yōu)于pEGFP-NI質(zhì)粒，而且成功地將Pre-MicroRNA-21與HBx-LE/6進(jìn)行共培培養(yǎng)，pEGFP-HBx組內(nèi)MicroRNA-21的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)儀器測(cè)量為1.77±0.24，顯著高于pEGFP-NI質(zhì)粒組內(nèi)的0.36±0.21，這些數(shù)據(jù)均表示穩(wěn)定表達(dá)HBx和miRNA-21基因的肝卵圓細(xì)胞株構(gòu)建成功。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達(dá)HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圓細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究HBx蛋白、miRNA-21、肝卵圓細(xì)胞與肝癌之間的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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