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      siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞遷移與增殖的影響

      2017-05-31 20:39:05劉麗敏劉麗洲趙娟張麗
      中國醫(yī)藥科學(xué) 2017年3期
      關(guān)鍵詞:細(xì)胞增殖宮頸癌

      劉麗敏 劉麗洲 趙娟 張麗

      [摘要]目的研究siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)m頸癌Hela細(xì)胞遷移與增殖的影響。方法采用Real Time-PCR、WesternBlot法檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后,Hela細(xì)胞中FOXF2基因mRNA、蛋白表達(dá)的變化;用劃痕試驗(yàn)檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后細(xì)胞的遷移能力,CCK8檢測siRNA沉默F(xiàn)OXF2后細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果Hela細(xì)胞內(nèi)FOXF2基因沉默后,Real Time-PCR、Western Blot檢測顯示siRNA沉默F(xiàn)OXF2組FOXF2基因mRNA、蛋白的表達(dá)均明顯下降(P<0.01);劃痕試驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P<0.01);CCK8檢測顯示siRNA沉默F(xiàn)OXF2組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論SiRNA沉默F(xiàn)OXF2基因促進(jìn)Hela細(xì)胞的遷移與增殖能力。

      [關(guān)鍵詞]宮頸癌;FOXF2;細(xì)胞遷移;細(xì)胞增殖

      [中圖分類號]R737.33

      [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

      [文章編號]2095-0616(2017)03-30-04

      宮頸癌是婦科最常見的生殖道惡性腫瘤之一,在全球其發(fā)病率僅次于乳腺癌。死亡率在婦科生殖道惡性腫瘤中占首位,其主要原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。當(dāng)前宮頸癌的治療方案主要是手術(shù)治療、放療、化療、生物治療及綜合治療等,多半在破壞腫瘤的同時(shí),其對正常的細(xì)胞組織也產(chǎn)生了或多或少的損傷。該疾病的發(fā)病原因涉及致癌基因的激活和或抑癌基因的失活以及表觀遺傳學(xué)的改變等,是多階段、多因子的復(fù)雜調(diào)控過程?,F(xiàn)宮頸癌明確的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,其靶向治療是科學(xué)界較熱門的研究內(nèi)容。又頭框轉(zhuǎn)錄因子F2(forkheadboxF2,F(xiàn)OXF2)蛋白是FOX家族的重要成員,它的特點(diǎn)是高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和組織特異性表達(dá)模式,它在細(xì)胞的生長和分化、調(diào)節(jié)胚胎的生成,和組織發(fā)展起著重要的作用。最近的研究表明,F(xiàn)OX基因的失調(diào)與腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展相關(guān)。有研究表明,F(xiàn)OXF2的低表達(dá)與乳腺癌患者的早發(fā)性轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。目前仍無FOXF2基因與宮頸癌的相關(guān)性報(bào)道。本研究從分子水平來闡述宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,為宮頸癌分子靶標(biāo)治療的篩選提供有力依據(jù)。

      1.材料與方法

      1.1材料

      人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,natocor),DMEM購自美國Gibco OptiMEM@I Medium和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectaminetm 3000購自美國Invitrogen公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司;Transwell小室購自美國Coming公司。RT-PCR試劑購自日本Takara。FOXF2 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,包含3條目的siRNA鏈,1條陰性對照siRNA鏈。Si-FOXF2 1305序列為:5GCAUCACUCUACU CCAGUGTT-3;Si-FOXF2 1415序列為:5-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3;Si-FOXF2 650序列為:5CCAGCGAGUUCAUG UUCGATT-3;陰性對照組(si-negative control)siRNA序列為:5-UUCUUCG AACGUGUCAC GUTT-3。兔抗人FOXF2 Ab、兔抗人GAPDH Ab購自美國Abcam公司。Hela細(xì)胞分為5組:Hela SNC組、Si-FOXF21305組、Si-FOXF2 1415組、Si-FOXF2 650組及未經(jīng)任何處理的Hela細(xì)胞作為對照組。

      1.2方法

      1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞復(fù)蘇,加入含100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素及10%FBS的DEME中培養(yǎng),置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi),24h內(nèi)更換培養(yǎng)液。對數(shù)生長期時(shí),用0.25%胰酶消化、傳代、凍存。

      1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天將Hela細(xì)胞接種于6孔板中,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)到30%一40%,PBS洗滌3遍,每孔加入900uLOptiMEM@IMedium。將3uL的Lip03000和5uL的siRNA分別與50uL的optiMEM@I Medium混懸,輕輕混勻后靜置5min。將含有Lip03000和siRNA的OptiMEM@I Medium輕輕混勻后靜置20min。將混勻的100uLDNA脂質(zhì)體復(fù)合物均勻滴入含有optiMEM@I Medium的細(xì)胞中。48h后提取RNA。

      1.2.3 Rea]Tme-PCR檢測各組FOXF2 mRNA的表達(dá)終點(diǎn)提取RNA,采用紫外/可見光分光光度儀測量細(xì)胞樣品總RNA的濃度和純度,(A260/A280)為1.9~2.1之間提示RNA質(zhì)量良好。隨按Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物序列為:GAPDH上游:5-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3,下游:5-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3;FOXF2上游:5TCGCTGGAGCAGAGC TACTT-3,下游:5CCCATTGAAGTI"GAGGACGA-3。最終獲得轉(zhuǎn)染率最高的si-Foxf2序列。

      1.2.4蛋白印跡法檢測的3組FOXF2蛋白的表達(dá)按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分為Hela SNC組、Si-FOXF2 1415組和未經(jīng)任何處理的SiHa細(xì)胞作為對照組。72h后加入適量的RIPA裂解液裂解細(xì)胞(凱基,南京1可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒(康為,北京)測蛋白濃度。GAPDH為內(nèi)參,按10%分離膠、6%濃縮膠制膠,按濃縮膠80V、分離膠120V恒壓電泳,200mA轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉1~2h,1×TBST洗滌后孵一抗(兔抗人FOXF2 1:1000,兔抗人GAPDH 1:10000)4°過夜,次日1×TBST洗滌后孵二抗(羊抗兔1:2000)1h,洗滌,ECL顯影(merckmillipore)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)待轉(zhuǎn)染后取細(xì)胞融合90%時(shí),用200uL移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕,用PBS洗滌3遍,換上DMEM培養(yǎng)液,分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72h在倒置顯微鏡下(10×10)測量劃痕的寬度。細(xì)胞遷移率=(1-即時(shí)劃痕寬度/原始劃痕寬度)×100%。

      1.2.6 CCK8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染24h后Hela SNC組、Si-FOXF2 1415組和未處理Hela組的細(xì)胞,用10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,在96孔板中加入100uL(9×103)的細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h。PBS洗滌3遍,將每孔加入90uL DMEM及10uL CCK8的混合液,避光,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1~4h。酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞活性公式:細(xì)胞增值率(%)=(處理組OD450-空白孔OD450)/(空白對照組OD450-空白孔OD450)]×100%。

      1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用(x±s)表示,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2.結(jié)果

      2.1 siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)ela細(xì)胞FOXF2mRNA表達(dá)的影響

      統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示方差不齊(F=3.82,P=0.039),使用Dunnett T3進(jìn)行各組見多重比較。結(jié)果顯示:3條siRNA鏈沉默F(xiàn)OXF2后,siRNA-FOXF2mRNA較Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組明顯下降(65%~85%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),其中siRNA-FOXF2 1415鏈下降最明顯,選取其后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1,表1。

      2.2 siRNA沉默F(xiàn)oxF2基因?qū)ela細(xì)胞FOXF2蛋白表達(dá)的影響

      Western blot結(jié)果顯示:siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因后,Hela細(xì)胞FOXF2蛋白表達(dá)水平較Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組明顯降低,進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。見圖2。

      2.3siR NA沉默F(xiàn)OXF2基因?qū)ela細(xì)胞遷移力的影響

      細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示,siRNA沉默F(xiàn)OXF2基因后,Hela細(xì)胞的遷移能力明顯高于Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組。見圖3。

      2.4 CCK8檢測siR.NA~FOXF2基因?qū)dafi~胞增殖的影響

      CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:siRNA-FOXF2 1415組細(xì)胞增殖率明顯高于Hela細(xì)胞SNC組及Hela細(xì)胞組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示方差齊(f=3.155,P=0.116)。見表2,圖4。

      3.討論

      宮頸癌跟大多數(shù)腫瘤相似,是以細(xì)胞過度增殖、無限生長為特征的疾病,體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞過度增殖,腫瘤組織的快速生長,進(jìn)而加劇惡性程度,該過程中主要的因素是癌基因的激活和或抑癌基因的失活。當(dāng)前宮頸癌的治療方案主要是手術(shù)治療、放療、化療、生物治療及綜合治療等,多半在破壞腫瘤的同時(shí),其對正常的細(xì)胞組織也產(chǎn)生了或多或少的損傷。且宮頸癌細(xì)胞對放化療出現(xiàn)越來越多的耐受現(xiàn)象,迫切需要對腫瘤細(xì)胞特異性的靶點(diǎn)治療。RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)、進(jìn)化過程高度保守、高效特異性的降解同源mRNA現(xiàn)象。將特異性siRNA轉(zhuǎn)染入生物細(xì)胞內(nèi)即可引發(fā)RNA干擾,進(jìn)而對特定基因的表達(dá)起到抑制作用。大量文獻(xiàn)表明,RNA干擾可用于治療單基因疾病和蛋白過度表達(dá)相關(guān)疾病。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖、凋亡失衡的結(jié)果,特異性靶向基因治療是提高治療效果的一個有效途徑。隨著siRNA技術(shù)的不斷進(jìn)步,多靶點(diǎn)的聯(lián)合治療在促腫瘤細(xì)胞凋亡及提高其對化療藥物的敏感性中發(fā)揮重要作用,具有良好的應(yīng)用前景。

      又頭框轉(zhuǎn)錄因子F2(forkhead boxF2,F(xiàn)OXF2)蛋白是FOX家族的重要成員,是間質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子,在與上皮相鄰的間質(zhì)中特異性表達(dá),調(diào)控上皮間質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化維持組織穩(wěn)態(tài)。研究表明FOXF2在前列腺良性增生及正常前列腺組織中高表達(dá),而在前列腺癌中較少表達(dá)。也有研究表明,F(xiàn)OXF2的低表達(dá)與乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移有關(guān),且提示預(yù)后不良。在癌細(xì)胞的調(diào)查研究表明FOXF2的低表達(dá)與細(xì)胞過度增殖相關(guān),這與本研究結(jié)果一致。SiRNA沉默F(xiàn)OXF2后,F(xiàn)OXF2的低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的遷移及增殖,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,進(jìn)而加重腫瘤的惡性程度。闡明了FOXF2與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為宮頸癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

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