毛挺挺， 方紅波， 王曉慧， 潘瑩瑩， 謝浩煌， 張宏宇， 肖 健， 姜麗萍

(1. 寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 315000； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325035；3. 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

堿性成纖維生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及其機(jī)制*

毛挺挺1， 方紅波1， 王曉慧2， 潘瑩瑩2， 謝浩煌2， 張宏宇2， 肖 健2， 姜麗萍3△

(1. 寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 315000； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325035；3. 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

目的：探討堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)下調(diào)氧自由基水平在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用。方法：采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠成肌細(xì)胞，隨機(jī)分為四組(n=6)：正常對(duì)照組(control)，單純bFGF組(bFGF)，氧化應(yīng)激組(H2O2)，干預(yù)組(bFGF+H2O2)。氧化應(yīng)激組采用含100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4 h。免疫組化檢測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)陽(yáng)性沉積顆粒；免疫熒光觀察活性氧自由基(ROS)水平、Bcl-2、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白(Bax)及細(xì)胞色素C (Cyt.C)表達(dá)；Western blot檢測(cè)Cyt.C、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低，ROS、Cyt.C表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與氧化應(yīng)激組比較，bFGF干預(yù)后的成肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)增加，ROS及Cyt.C表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論：bFGF對(duì)成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與bFGF下調(diào)氧自由基水平、Bcl-2蛋白增加、Cyt.C表達(dá)減少有關(guān)。

壓瘡深部組織損傷；氧化應(yīng)激；大鼠成肌細(xì)胞；bFGF

【DOI】 10.12047/j.cjap.5446.2017.040

壓瘡深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)好發(fā)于受壓骨隆突處，為壓瘡中最為惡性分型，亦是臨床護(hù)理重難點(diǎn)[1]。此類壓瘡以皮膚深部組織肌層損傷為特點(diǎn)，局部持續(xù)受壓時(shí)，血流灌注受阻，產(chǎn)生大量自由基造成肌細(xì)胞損傷。研究表明[2，3]相比

單純壓力性損傷，缺血再灌注損傷對(duì)壓瘡深部組織損傷的形成更為重要，反復(fù)再灌注中加劇的自由基可使壓瘡深部肌細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凋亡。過(guò)氧化氫(H2O2)為典型的活性氧自由基，同機(jī)體氧化應(yīng)激主要成分一致，目前已見(jiàn)于體外DTI研究之中[4]。堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種多能細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)多種損傷效果確切，已廣泛用于多種外傷治療中，尚未見(jiàn)相關(guān)體外DTI的研究，因此探討bFGF調(diào)控成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激作用及其相關(guān)蛋白表達(dá)，或許可以深入了解深部組織損傷機(jī)理，為其防治提供新視野。

1 材料與方法

1.1 大鼠成肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

大鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，采用1%青/鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，分為4組(n=6)：正常對(duì)照組(control)：正常培養(yǎng)的大鼠成肌細(xì)胞，未做任何處理，培養(yǎng)時(shí)間同其他組；單純bFGF組(bFGF)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成肌細(xì)胞，提前2 h加入終濃度為100 ng/ml的bFGF，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；氧化應(yīng)激組(H2O2)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成肌細(xì)胞，加入終濃度為100 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；干預(yù)組(bFGF+H2O2)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成肌細(xì)胞，提前2 h加入終濃度為100 ng/ml bFGF，其后加入終濃度為100 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2 主要試劑

bFGF由溫州生物與天然藥物研究所提供，H2O2購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品；Hoechst 33258，活性氧自由基檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；兔多克隆抗體B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2 sc-492)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax sc-493)，鼠多克隆抗體細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt.C sc-13156)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP sc-7150)及實(shí)驗(yàn)中所用的二抗羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、羊抗兔IgG- HRP、驢抗兔IgG-FITC(異硫氰酸熒光素)，驢抗鼠IgG-PE(藻紅蛋白)均由Santa Cruz公司提供。

1.3 主要檢測(cè)方法

1.3.1 成肌細(xì)胞中ROS表達(dá)檢測(cè) 取各組細(xì)胞避光加入活性氧自由基熒光探針，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育15 min。PBS清洗3次以除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)熒光探針更換完全培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)Bcl-2表達(dá) 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法(strept avidin-biotin complex, SABC)，4%多聚甲醛固定，3% H2O2-甲醇溶液抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5% BSA封閉30 min，Bcl-2一抗?jié)舛染鶠?∶200，常規(guī)設(shè)立陰性對(duì)照(用PBS代替一抗)，于4℃冰箱過(guò)夜。滴加1∶1 000稀釋的二抗，置于37℃恒溫箱孵育2 h。PBS洗去未結(jié)合抗體，DAB顯色，蘇木素染核，干燥后中性樹(shù)膠封片，鏡下陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。

1.3.3 免疫熒光檢測(cè)Cyt.C等蛋白表達(dá)情況 4%多聚甲醛4℃固定，Triton X-100靜置15 min后，5% BSA室溫封閉15 min，滴加1∶200稀釋的Bcl-2、Bax、Cyt.C一抗，4℃過(guò)夜。PBS 3次5 min洗去未結(jié)合抗體，避光滴加1∶300稀釋的熒光二抗，黑色濕盒內(nèi)37℃孵育1 h。Hoechst 復(fù)染7 min，PBS清洗3次5 min，滴加抗熒光淬滅劑并封片。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(×400)，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件處理圖片，統(tǒng)計(jì)任意單位內(nèi)平均熒光亮度。

1.3.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)Cyt.C、PARP蛋白表達(dá) 收集不同批次肌細(xì)胞，加裂解液后刮取蛋白液，離心取上清，采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度。通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離蛋白后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST 3×7 min洗去脫脂奶，鼠多克隆Cyt.C、PARP、GAPDH抗體4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3×7 min，HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶5 000) 室溫孵育1 h，最后加入ECL顯色液于凝膠成像儀器曝光。GAPDH作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。運(yùn)用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，統(tǒng)計(jì)各蛋白相對(duì)灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組成肌細(xì)胞中ROS的水平

正常對(duì)照組及單純bFGF組成肌細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度較弱。氧化應(yīng)激組在H2O2刺激4 h 后，成肌細(xì)胞ROS熒光呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)明顯收縮，突觸變短。與應(yīng)激組相比，干預(yù)組預(yù)給bFGF 2 h顯著下調(diào)氧化應(yīng)激強(qiáng)度 (圖1，表1) 。

Fig. 1 ROS of myoblasts induced by 100 μmol/L hydrogen peroxide post 4 hours(×400) A: Control; B: bFGF; C: H2O2; D: bFGF+H2O2； bFGF: Basic fibroblast growth factor; ROS: Reactive oxygen species

2.2 bFGF對(duì)成肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

Bcl-2免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。正常對(duì)照組及單純bFGF組成肌細(xì)胞可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)含有大量Bcl-2陽(yáng)性顆粒；氧化應(yīng)激組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)銳減；干預(yù)組采用bFGF預(yù)處理2 h，可見(jiàn)Bcl-2陽(yáng)性顆粒增多，細(xì)胞損傷減小(圖2，表1)。

Fig. 2 Immunohistochemistry for Bcl-2 (×200) A: Control; B: bFGF; C: H2O2; D: bFGF+H2O2; Bcl-2: B-cell lymphoma-2

2.3 bFGF對(duì)成肌細(xì)胞Cyt.C表達(dá)的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)：正常對(duì)照組及單純bFGF組Cyt.C熒光較弱。氧化應(yīng)激組Cyt.C熒光明顯增強(qiáng)，同時(shí)胞外存在紅色彌漫性熒光顆粒。干預(yù)組胞Cyt.C熒光局限于胞質(zhì)內(nèi)且熒光顆粒染色較淺，預(yù)給bFGF能夠穩(wěn)定Cyt.C并減少胞外釋放量(圖3)。

2.4 bFGF對(duì)成肌細(xì)胞Cyt.C和PARP表達(dá)影響

結(jié)果可見(jiàn)：正常對(duì)照組及單純bFGF組Cyt.C，PARP蛋白表達(dá)較少，氧化應(yīng)激組Cyt.C，PARP蛋白表量明顯增加。預(yù)給bFGF 2小時(shí)，氧化應(yīng)激中成肌細(xì)胞Cyt.C及PARP表達(dá)量下調(diào)。(圖4，表1)

Fig. 3 Immunofluorescence expression of Cyt.C post 4 hours (×400) A: Control; B: bFGF; C: H2O2; D: bFGF+H2O2; Cyt.C: Cytochrome C

Tab. 1 Relative expression for ROS，Cyt.

Con: Control; ROS: Reactive oxygen species; Cyt.C: Cytochrome C; PARP: Poly ADP-ribose polymerase; Bcl-2: B-cell lymphoma-2; Bax: Bcl-2 associated X protein

**P<0.01vsCon;?#P<0.05,##P<0.01vsH2O2

3 討論

壓瘡為臨床護(hù)理質(zhì)控重點(diǎn)部分，壓瘡分期中以DTI最為嚴(yán)重。研究表明[5]，壓瘡并非急性高壓力性損傷，而是由間歇性較低壓力重復(fù)作用造成局部不完全缺血再灌注損傷。作為與在體研究互補(bǔ)的細(xì)胞水平，具有分離分析氧化應(yīng)激對(duì)肌細(xì)胞損傷的優(yōu)點(diǎn)，能夠在微觀水平實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析bFGF對(duì)肌細(xì)胞氧化應(yīng)激性損傷作用，亦可開(kāi)拓壓瘡深部組織損傷研究思路。

當(dāng)前體外細(xì)胞氧化應(yīng)激模型可有單純?nèi)毖跄Ｐ图斑^(guò)氧化氫刺激性模型等，缺氧模型在一定程度上也能產(chǎn)生氧自由基。研究發(fā)現(xiàn)[6，7]，缺血再灌注造成大鼠壓瘡肌肉組織病變比單純?nèi)毖毖鯎p傷更為嚴(yán)重，丙二醛、乳酸脫氫酶等指標(biāo)皆顯著高于同期缺血組。氧化應(yīng)激造成壓瘡深部組織損傷產(chǎn)生為缺血基礎(chǔ)上不完全再灌注的反復(fù)發(fā)生，單單缺氧尚不能產(chǎn)生DTI。過(guò)氧化氫[8]作為氧化應(yīng)激典型活性氧自由基，為機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要成分，目前外源性雙氧水引起損傷過(guò)程同體內(nèi)反應(yīng)相似，在體外氧化應(yīng)激應(yīng)用中最為普遍。我們前期已應(yīng)用不同濃度H2O2及多個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)100 μmol/L濃度以下的H2O2在2 h內(nèi)具有促細(xì)胞增殖效應(yīng)，而此濃度以上的肌細(xì)胞2 h后表現(xiàn)為應(yīng)激性損傷，其損傷與過(guò)氧化氫濃度具有量效關(guān)系。因此，100 μmol/L H2O2濃度可能是體外肌細(xì)胞損傷閾值，至4 h細(xì)胞活性降至75%可作為本研究應(yīng)激組[4]。

Tai等[9]研究表明真核動(dòng)物在正常生理狀態(tài)下仍會(huì)生成少量氧自由基作為介導(dǎo)生命活動(dòng)的信號(hào)。應(yīng)激組肌細(xì)胞自由基熒光呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞皺縮，突觸變短。相比應(yīng)激組，結(jié)果顯示bFGF干預(yù)的成肌細(xì)胞氧自由基表達(dá)下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示bFGF緩解肌細(xì)胞損傷與其下調(diào)氧自由基過(guò)程相關(guān)。

目前認(rèn)為機(jī)體90%以上的氧自由基皆來(lái)自線粒體，線粒體作為機(jī)體氧化磷酸化的最主要部位，正常條件下處于穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體為自由基攻擊，致使功能受損，發(fā)生細(xì)胞凋亡[10]。文獻(xiàn)表明[11，12]，Bcl-2抗凋亡基因家族對(duì)ROS的調(diào)節(jié)最為重要，Bcl-2拮抗應(yīng)激過(guò)程中Bax凋亡蛋白，通過(guò)與Bax相互作用形成異源性多聚體調(diào)節(jié)線粒體通道孔隙，從而抑制凋亡發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)正常成肌細(xì)胞及單純給予bFGF的成肌細(xì)胞組較少表達(dá)Bax，在氧化應(yīng)激過(guò)程中存在Bax激增現(xiàn)象，同沈王月等[13]研究報(bào)道一致，推測(cè)過(guò)多生成的Bax蛋白形成同源聚合體是啟動(dòng)肌細(xì)胞凋亡的重要因素。bFGF干預(yù)的肌細(xì)胞呈現(xiàn)Bcl-2蛋白水平上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下降現(xiàn)象，在一定程度上提示bFGF保護(hù)大鼠成肌細(xì)胞的作用可能與上調(diào)Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

Cyt.C位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，促使細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿，成為觸發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。Kuwana等[15]研究發(fā)現(xiàn)重組Bax可以獨(dú)自從完整脂質(zhì)體中釋放出用熒光標(biāo)記的細(xì)胞色素C蛋白，且計(jì)算結(jié)果顯示該通道是由4個(gè)Bax分子組成，它的直徑正好使細(xì)胞色素C分子通過(guò)。Marsden等[16]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中，Cyt.C可在三磷酸腺苷(ATP)作用下結(jié)合凋亡蛋白激活因子形成復(fù)合物，最終激活特定凋亡蛋白酶誘發(fā)細(xì)胞凋亡。PARP作為細(xì)胞凋亡核心蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)的切割底物，在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究顯示[17]，高度活化的PARP可反向加劇自由基生成，增加氧化應(yīng)激水平。本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞細(xì)胞色素C免疫熒光外漏呈片狀彌漫性分布，細(xì)胞凋亡水解產(chǎn)物PARP表達(dá)急劇增高。bFGF干預(yù)的成肌細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)Cyt.C紅色熒光顆粒分布均勻，染色較淺，PARP表達(dá)尚處較低水平，這與朱宇麟等[18]報(bào)道積極干預(yù)可減弱線粒體透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放強(qiáng)度，細(xì)胞色素C釋放下降，細(xì)胞凋亡減少的結(jié)果相似。

綜上所述，本研究在體外細(xì)胞水平初步探討了bFGF對(duì)大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，或許可為壓瘡深部組織損傷提供新的防治思路。

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*【基金項(xiàng)目】國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260111)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中青年人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(NYTD-2015003)

Effects and mechanism of bFGF on rat myoblast oxidative injury induced by hydrogen peroxide

MAO Ting-ting1, FANG Hong-bo1, WANG Xiao-hui2, PAN Ying-ying2, XIE Hao-huang2,ZHANG Hong-yu2, XIAO Jian2, JIANG Li-ping3△

(1. Ningbo Medical Center Lihuili Eastern Hospital, Ningbo 315000; 2. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035;3. Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092, China)

Objective: To explore the protective role of basic fibroblast growth factor (bFGF) on attenuating hydrogen peroxide-induced injury in cultured rat myoblasts. Methods: Cultured rat myoblasts at growth phase were randomly divided into four groups (n=6): control group (control), bFGF group (bFGF), model group(H2O2) and the treatment group (bFGF+H2O2). Model group was treated with 100 μmol/L hydrogen peroxide for 4h. B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) positive particles were detected by immunohistochemistry; Reactive oxygen species (ROS) and expression for Bcl-2 associated X protein (Bax), Bcl-2 and Cytochrome C (Cyt.C) fluorescence were observed under the invented microscope; Cyt.C and Poly ADP-ribose polymerase(PARP)protein were assessed by Western blot. Results: Compared with control group, the myoblats in the model group showed low expression of Bcl-2 positive particles, accompanied by high expression of ROS level and Cyt.C fuorescence (P<0.05); Compared with model group, bFGF enhanced Bcl-2 activity of the myoblasts, and significantly downregulated Cyt.C and PARP expression (P<0.05). Conclusion: bFGF could attenuate oxidative injury of rat myoblasts induced by hydrogen peroxide, which mechanism might be related to enhanced Bcl-2 and reduced ROS, Cyt.C levels.

pressure ucler; deep tissue injury; oxidative stress; rat myoblasts; bFGF

國(guó)家自然科學(xué)基金(81372064)；上海市教委護(hù)理高原學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目

2016-04-11

2016-11-22

R363.2; R471

A

1000-6834(2017)02-159-05

△【通訊作者】Tel： 13868311990； E-mail： ljpingj@shsmu.edu.cn