從日本進(jìn)境羅漢松中截獲移去劍線蟲

龍 海, 齊小峰, 謝泳桂, 李一農(nóng), 李芳榮*

(1. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳 518001; 2. 深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳 518045)

有害生物動(dòng)態(tài)
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從日本進(jìn)境羅漢松中截獲移去劍線蟲

龍 海1,2, 齊小峰1, 謝泳桂1, 李一農(nóng)1, 李芳榮1*

(1. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳 518001; 2. 深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳 518045)

2016年11月,深圳口岸從日本進(jìn)境羅漢松中截獲一種劍線蟲。采用貝曼漏斗法分離線蟲,結(jié)合形態(tài)學(xué)、28S rRNA基因序列測定以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,對分離的線蟲進(jìn)行鑒定。該線蟲的28S rRNA基因序列和GenBank 數(shù)據(jù)庫中的移去劍線蟲Xiphinemaelongatum(登錄號(hào)分別為EF140790、KF430803、KF430802和KF430801)的序列同源性高達(dá)99%;其形態(tài)特征和測計(jì)值與X.elongatum最為吻合;系統(tǒng)發(fā)育樹表明該線蟲和X.elongatum聚為一組。通過以上結(jié)果判定截獲的線蟲為移去劍線蟲。劍線蟲是一種重要的植物外寄生線蟲,我國口岸曾經(jīng)多次截獲劍線蟲,劍線蟲入侵我國的風(fēng)險(xiǎn)較高。本文首次對日本羅漢松中的移去劍線蟲進(jìn)行了詳細(xì)的描述,提供了該線蟲新的地理分布信息。

移去劍線蟲; 羅漢松; 形態(tài)學(xué); 分子鑒定

劍線蟲屬Xiphinema線蟲是一類重要的外寄生線蟲,它們在植物根部取食,嚴(yán)重破壞根組織,影響根系生長。除取食危害以外,一些劍線蟲作為植物病毒的傳播介體對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。已報(bào)道的劍線蟲屬線蟲有296種[2],其中劍線蟲傳毒種被列入我國檢疫性有害生物名錄。隨著我國進(jìn)口苗木種類和數(shù)量越來越多,劍線蟲傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)日益加大。我國口岸曾多次從進(jìn)境種苗中截獲劍線蟲,深圳口岸近年來從日本進(jìn)境苗木中就曾截獲過短頸劍線蟲X.brevicollum、湖南劍線蟲X.hunaniense、標(biāo)明劍線蟲X.insigne、美洲劍線蟲X.americanum、太平洋劍線蟲X.radicicola等。劍線蟲入侵我國的風(fēng)險(xiǎn)可見一斑。

2016年11月深圳口岸從日本進(jìn)境的羅漢松樣品中分離到一種劍線蟲。通過對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察、測量,28S rRNA基因序列測定以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,鑒定為移去劍線蟲X.elongatum。本文對上述過程進(jìn)行了詳細(xì)描述,為口岸檢疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

口岸現(xiàn)場取羅漢松的根和根際土壤約500 g,放入封口袋中,做好標(biāo)簽,送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 線蟲分離

采用貝曼漏斗法分離線蟲[3]。取約250 g樣品,用雙層紗布包好,置于漏斗中,25℃靜置24～48 h。用凹面皿接取線蟲懸浮液10 mL,在體式顯微鏡下鏡檢。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

用挑針挑取線蟲制成臨時(shí)玻片[4],在Zeiss Zmager MI光學(xué)顯微鏡下對線蟲的整體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。用顯微鏡自帶的Zeiss AxioCam HRC數(shù)碼相機(jī)對線蟲進(jìn)行拍照,并用Axio Vision 4.8.2自帶的測量軟件和de Man公式法[5]對線蟲進(jìn)行測計(jì)。

1.4 分子生物學(xué)檢測

1.4.1 單條線蟲DNA提取

參照Long等[6]的方法。取12 μL裂解緩沖液(1×ExTaqBuffer(Mg2+free),100 μg/mL蛋白酶K,2 mmol/L MgCl2)到潔凈的載玻片上,將線蟲挑到裂解緩沖液中并碾碎,把上述線蟲懸液轉(zhuǎn)移到PCR薄壁管中,-80℃放置30 min,再轉(zhuǎn)移到PCR儀上,60℃加熱1 h,95℃加熱15 min,經(jīng)上述步驟處理的線蟲粗提液用于PCR擴(kuò)增。

1.4.2 PCR擴(kuò)增

28S rRNA基因序列擴(kuò)增采用的引物對為:D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3Br(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)[7]。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括10×ExTaqBuffer(Mg2+free)4 μL,25 mmol/L MgCl23.2 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL,5 U/μLExTaq0.2 μL,10 μmol/L D2A/D3Br引物各4 μL,線蟲粗提液10 μL,加滅菌水定容至50 μL。PCR反應(yīng)程序參照de Ley 等[7]的方法,94 ℃預(yù)變性4 min;94℃ 30 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,40個(gè)循環(huán);最后72℃保溫10 min,使反應(yīng)產(chǎn)物充分延伸。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的檢測、測序和序列分析

取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳20 min,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照,如果出現(xiàn)目標(biāo)條帶,將余下的PCR產(chǎn)物送華大基因有限公司測序,用BioEdit 7.0[8]對序列進(jìn)行編輯,在GenBank 數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行BLAST分析,選取同源性較高的劍線蟲的28S rRNA基因序列,用MEGA 4.0[9]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在光學(xué)顯微鏡下觀察分離到的線蟲形態(tài)(圖1)。雌蟲腹面彎曲,熱殺死后呈“C”形,體環(huán)不明顯。角質(zhì)膜有兩層,內(nèi)層角質(zhì)膜在尾端明顯增厚。唇區(qū)微縊縮?？卺樅驼T導(dǎo)環(huán)結(jié)構(gòu)典型。食道球長圓柱狀,長86 ～105 μm,寬21 ～25 μm。陰門位于蟲體前約1/3處,雙生殖腺,均發(fā)育完全,卵巢回折。尾圓錐形,腹面彎曲,長度約為肛門處體寬的2.5～3.5倍,每側(cè)3個(gè)尾孔。雄蟲未發(fā)現(xiàn)。

2.2 形態(tài)測量值

從日本進(jìn)境羅漢松中分離的劍線蟲,形態(tài)特征和測量值(表1)與文獻(xiàn)報(bào)道的X.elongatum最為接近,故初步將其鑒定為X.elongatum。

2.3 分子生物學(xué)數(shù)據(jù)分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序(GenBank登錄號(hào)KY348743),將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明,劍線蟲日本群體的28S rRNA基因序列與GenBank登錄號(hào)分別為EF140790、KF430803、KF430802和KF430801的X.elongatum序列相似度高達(dá)99%?；?8S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)也顯示該線蟲與X.elongatum位于一個(gè)進(jìn)化枝上,親緣關(guān)系最近。綜合上述形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)分析,判定截獲的日本劍線蟲為移去劍線蟲。

圖1 日本羅漢松中移去劍線蟲的光學(xué)顯微圖片F(xiàn)ig.1 Photomicrographs of Xiphinema elongatum intercepted in Podocarpus macrophyllus from Japan

種群Population數(shù)量Number體長/mmLabcc'V日本Japan232.23±0.2(2.0～2.6)53.0±4.4(43.0～58.5)6.8±1.0(5.6～9.4)34.4±3.5(30.1～45.4)3.0±0.3(2.5～3.5)38.9±2.0(34.4～43.5)剛果[10](全模標(biāo)本)Zaire(holotype)12.089496.1352.540埃塞俄比亞[11]Ethiopia42.38±0.71(2.33～2.43)69±7.0(64～74)7.2±0.5(6.9～7.6)33.2±5.8(29.1～37.3)2.7±0.1(2.6～2.8)41.3±0.3(41～41.7)泰國[12]Thailand52.30(2.15～2.45)51.3(47.9～55.7)—37.4(36.9～39.6)2.6(2.5～2.8)38.4(35.1～40.5)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

種群Population數(shù)量Number體長/mmLabcc'V菲律賓[12]Philippines202.47±0.18(2.11～2.72)56.1±4.3(49.8～68.2)—34(32～37)(n=8)2.8±0.2(2.6～3.2)39.9±1.6(37.0～43.0)中國福建[13]Fujian,China62.11±0.13(1.89～2.25)54±3.8(49～60)6.5±0.2(6.3～6.8)36±2.0(33～39)2.6±0.1(2.4～2.8)41±1.1(40～43)中國臺(tái)灣[14]Taiwan,China252.00±0.11(1.77～2.17)57.7±4.9(47.8～65.8)6.0±0.3(5.5～6.4)35.7±1.9(31～40)2.6±0.2(2.3～2.9)39.6±1.3(36.3～42.7)種群Population齒針長/μmOdontostylelength齒針延伸部長/μmOdontophorelength口針長/μmStyletlength唇寬/μmLipwidth肛門處體寬/μmAnalbodywidth尾長/μmTaillength日本Japan93.7±4.4(83.7～102.7)60.6±2.7(51.3～63.1)154.3±4.6(143.3～160.1)11.8±0.5(10.7～12.8)21.8±1.2(19.6～24.5)65.1±5.6(50.5～75.6)剛果[10](全模標(biāo)本)Zaire(holotype)94591531423.659埃塞俄比亞[11]Ethiopia78±12(70～86)51±7(46～55)—11±1(10～11)22±3(20～24)65.1±2.7(62.5～68.0)泰國[12]Thailand93±1.8(91～95)57±1.6(55～59)150±2.2(147～153)——61.5(58～65)菲律賓[12]Philippines91±2.0(89～97)61±2.3(56～65)152±1.5(149～154)——64(n=8)(58～70)中國福建[13]Fujian,China90±3.9(83～93)56±3.2(51～60)146±5.3(138～151)11.5±0.5(11.0～12.0)22.0±1.3(20.5～23.5)58±2.9(56～62)中國臺(tái)灣[14]Taiwan,China88.3±2.4(83.3～92.5)56.7±1.6(55.0～61.7)145.1±3.2(140.0～151.7)11.8±0.5(10.7～12.8)22.0±1.0(20.0～24.0)56.0±3.0(51.0～63.0)

1)n=測計(jì)樣本數(shù);L=體長;a=體長/最大體寬;b=體長/體前端至食道與腸連接處的距離;c=體長/尾長;c′=尾長/肛門處體寬;V=體前端至陰門的距離×100/體長?！啊北硎緹o數(shù)據(jù)。n=Number of measured samples;L=Body length;a=Body length/maximum body width;b=Body length/the distance from body front to esophagus and intestines junction;c=Body length/tail length;c′=Tail length/anal body width;V=The distance of body front to vulva×100/body length.‘—’ means no data.

圖2 基于28S rRNA基因序列構(gòu)建的部分劍線蟲屬種群系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based upon sequences of D2-D3 expansion region of the 28S rRNA gene of some Xiphinema spp.

3 討論

移去劍線蟲日本種群的形態(tài)特征和文獻(xiàn)描述的形態(tài)特征[10-14]相符。日本種群的形態(tài)測量值和其他種群比較結(jié)果顯示,和全模標(biāo)本相比,c值、V值、齒針長、齒針延伸部長以及口針長非常吻合,其他測量值雖然存在一定差異,但是全模標(biāo)本的各項(xiàng)單一測量值都在日本種群的范圍內(nèi)(表1)。日本種群的各測量值和菲律賓種群的一致性較高(表1)。和埃塞俄比亞種群相比,c值、c′值、V值、唇寬、肛門處體寬和尾長比較接近,其他各測量值存在差異,除了a值,埃塞俄比亞種群的測量值都在日本種群的范圍之內(nèi),而埃塞俄比亞種群的a值大于其他種群,但與菲律賓和中國臺(tái)灣種群沒有重疊(表1)。日本種群的各測量值和泰國、中國的種群相比,雖然存在差異,但是測量范圍都有重疊(表1)。Luc等[15]根據(jù)尾長和口針長度,將不同地理來源的移去劍線蟲種群分成兩類,第一類尾長48～54 μm,口針等于或大于164 μm,這一類源自西非;第二類尾長59～67 μm,口針等于或小于161 μm,此類主要來自東非、東南亞和太平洋地區(qū)。依據(jù)此二分法,日本群體屬于第二類。

移去劍線蟲起源于非洲剛果[10]。其后在夏威夷[16]、南非[17]、南美的蘇里南[18]和巴西[19]等地均有報(bào)道,我國僅有零星分布[13-14]。不同地理來源的移去劍線蟲在形態(tài)特征和測量值之間都存在差異,需要輔以分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。本文通過28S rRNA基因序列擴(kuò)增,測序,BLAST比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,最終判定日本羅漢松中截獲的劍線蟲為移去劍線蟲。本文首次對移去劍線蟲的日本群體進(jìn)行了詳細(xì)描述。近年來,我國進(jìn)口的苗木量不斷攀升,危險(xiǎn)性線蟲入侵的風(fēng)險(xiǎn)也與日俱增,僅深圳口岸從日本和泰國進(jìn)境的苗木中截獲的線蟲種類就有劍線蟲、長針線蟲、毛刺線蟲、擬毛刺線蟲、根結(jié)線蟲、短體線蟲、類短體線蟲和隱皮孢囊線蟲等。口岸檢疫部門需加強(qiáng)對進(jìn)口苗木的檢疫監(jiān)管,防止危險(xiǎn)性線蟲隨苗木入侵我國,保護(hù)我國的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Xiphinemaelongatumintercepted inPodocarpusmacrophyllusfrom Japan

Long Hai1,2, Qi Xiaofeng1, Xie Yonggui1, Li Yinong1, Li Fangrong1

(1. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518001, China;2. Shenzhen Key Laboratory of Inspection Research & Development of Alien Pests,Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518045, China)

In November 2016, oneXiphinemapopulation was detected in the roots ofPodocarpusmacrophyllusimported from Japan in Shenzhen port, China. The nematode was extracted using modified Baermann method and identified based on morphology, morphometrics, 28S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis. The 28S rRNA gene sequence of the nematode matched well (99% similarity) with that ofXiphinemaelongatumdeposited in GenBank (GenBank accession number EF140790, KF430803, KF430802 and KF430801). The morphological characteristics and morphometrics of the nematode were highly consistent with those ofX.elongatum. The phylogenetic analysis showed that the nematode andX.elongatumwere clustered into one group. It is concluded that the intercepted nematode isX.elongatum.Xiphinemaspp. are important ecto-parasitic nematodes, which have been repeatedly intercepted by Chinese ports, and the invasion risk of these nematodes to China is high. This paper first gives a detailed description ofX.elongatuminP.macrophyllusfrom Japan and provides new geographical distribution information of this nematode.

Xiphinemaelongatum;Podocarpusmacrophyllus; morphology; molecular identification

2017-02-09

2017-03-15

S 432.45

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.040

* 通信作者 E-mail: lifangr@126.com