進(jìn)境高粱種子中葡萄莖枯病菌的檢疫鑒定

張 宇, 許萍萍, 吳 晶, 楊 靜, 李 彬, 吳翠萍*

(1. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局, 南京 210001; 2. 江蘇省南京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 南京 210001)

進(jìn)境高粱種子中葡萄莖枯病菌的檢疫鑒定

張 宇1, 許萍萍2, 吳 晶2, 楊 靜1, 李 彬1, 吳翠萍1*

(1. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局, 南京 210001; 2. 江蘇省南京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 南京 210001)

從進(jìn)境的美國(guó)高粱樣品中分離到一株與葡萄莖枯病菌Didymellaglomerata相似的菌株4358-17。其菌落形態(tài)和顯微特征均與葡萄莖枯病菌一致。多個(gè)位點(diǎn)(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列比對(duì)顯示菌株4358-17與GenBank登錄號(hào)為KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896的葡萄莖枯病菌相似性均達(dá)到100%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明菌株4358-17與葡萄莖枯病菌株聚集在同一個(gè)分支上,支持率為99%。菌株4358-17接種高粱和小麥葉片,4 d后接種部位出現(xiàn)明顯癥狀。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,將進(jìn)境美國(guó)高粱樣品中分離的菌株4358-17鑒定為葡萄莖枯病菌。

葡萄莖枯病菌; 形態(tài)特征; 系統(tǒng)發(fā)育分析; 致病性測(cè)試

葡萄莖枯病菌Didymellaglomerata(Corda) Chen & Cai具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性,能夠在死亡植株、空氣、海水和土壤等多種生境下存活。該菌曾經(jīng)被認(rèn)為是一種弱致病真菌[1]，但近年來(lái)大量的研究發(fā)現(xiàn)它可導(dǎo)致嚴(yán)重的病害,給農(nóng)作物和水果等造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Milatovic[2]報(bào)道了葡萄莖枯病菌引起克羅地亞葡萄減產(chǎn)80%。Lahoz等[3]報(bào)道在2005年和2006年的秋季,由于葡萄莖枯病菌侵染,意大利南部數(shù)百萬(wàn)株的茴香嚴(yán)重倒伏,根部壞死,部分濕度較高的地區(qū)侵染率甚至達(dá)到100%。由于該病菌可以通過(guò)種子進(jìn)行傳播,因此是一種潛在的危險(xiǎn)性病原菌[4-5]。該菌已被列入我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄,是一種檢疫性植物病原真菌。

葡萄莖枯病菌的寄主范圍很廣,目前為止已經(jīng)從100多個(gè)屬的植物上分離到了該菌,它通常出現(xiàn)于種子的表面[6]。葡萄莖枯病菌可引起葡萄枯萎病[7]、小麥和橡皮樹(shù)葉斑病[8-9]、胡荽莖腐病[10]、茴香冠腐病[11]、花生芽枯病[12]、桃樹(shù)潰瘍病[13]等多種病害。該菌廣泛分布于意大利、希臘、瑞典、印度、澳大利亞、以色列、秘魯、匈牙利、美國(guó)等國(guó)家。目前為止在我國(guó)僅在五味子和牡丹上有兩例報(bào)道[14-15]。

2016年3月,江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局從一批美國(guó)進(jìn)境的高粱樣品中分離獲得了一株疑似葡萄莖枯病菌株4358-17,并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)觀察、序列比對(duì)、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析和致病性測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料:供試高粱樣品為美國(guó)進(jìn)境的高粱種子,進(jìn)境時(shí)間為2016年3月19日,試驗(yàn)樣品編號(hào)為201604358。致病性測(cè)定所用高粱、小麥、大麥為實(shí)驗(yàn)室保存的進(jìn)境樣品。

試劑:植物總DNA提取試劑盒(Tiangen),PCR反應(yīng)試劑(TaKaRa),瓊脂糖,PDA培養(yǎng)基,次氯酸鈉消毒液。

儀器:低溫破碎儀,振蕩型恒溫金屬浴,離心機(jī),體視顯微鏡,全自動(dòng)萬(wàn)能顯微鏡,高清數(shù)字成像設(shè)備,生物安全柜,恒溫培養(yǎng)箱,PCR儀,電泳儀,凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 病變樣品的選取

將口岸送檢的原始高粱種子過(guò)鋁制樣品分樣套篩,套篩的網(wǎng)孔直徑從上到下依次是3.5、3.0、2.0、1.2 mm。分別收集2.0 mm孔徑和1.2 mm孔徑篩下物,置于直徑9 cm的潔凈培養(yǎng)皿中,在體視解剖鏡下挑取皺縮、變色、表面有子實(shí)體的種子及碎屑。選取150～200粒(塊)為一份樣品,共選取了3份樣品。

1.3 病原菌的分離與純化

將樣品用1%的次氯酸鈉溶液消毒3 min,用無(wú)菌水漂洗3次,用無(wú)菌吸水紙吸干種子及碎屑表面的水分,置于加有抗生素的PDA平板上(青霉素和硫酸鏈霉素的添加濃度均為100 μg/mL)。每皿放置5塊,于25℃下黑暗培養(yǎng)。觀察病菌菌落生長(zhǎng)情況,將長(zhǎng)出的菌落及時(shí)轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上純化培養(yǎng),從形態(tài)不同的菌落邊緣挑取菌絲塊轉(zhuǎn)移到新鮮PDA培養(yǎng)基上。純化2～3次以保證所得菌落為純培養(yǎng)。

1.4 病原菌形態(tài)鑒定

觀察記錄PDA平板上的病菌菌落形態(tài)、顏色變化和氣生菌絲的疏密程度。測(cè)量菌落生長(zhǎng)速度,并用高清數(shù)字成像設(shè)備拍攝菌落形態(tài)特征。在立體顯微鏡和顯微鏡下觀察分生孢子器、分生孢子和厚垣孢子形態(tài)特征,進(jìn)行拍照,并使用AxioVision Rel. 4.5軟件記錄其形態(tài)并測(cè)量大小,根據(jù)病菌的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.5 序列分析

1.5.1 菌絲DNA提取[16]

將獲得的菌株接種于PDA平板上培養(yǎng)7 d,用解剖刀刮取適量菌絲于2 mL Eppendorf離心管內(nèi),加入40 μL 0.5 mol/L NaOH以及一顆直徑3 mm的鋼珠,在破碎儀上以30次/s研磨5 min,取下后12 000 r/min離心10 min,取5 μL上清液以100 mmol/L Tris (pH 8.0)進(jìn)行10倍稀釋。所提取的病菌DNA用于PCR擴(kuò)增。

1.5.2 序列擴(kuò)增

反應(yīng)體系:DNA 1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，rTaq0.2 μL,雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,52℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min后保存于4℃。

1) ITS: Internal transcribed spacer regions 1 & 2 including 5.8S rDNA gene; LSU: 28S large subunit of the nuclear rRNA gene; ACT: actin; TUB2:β-tubulin.

1.5.3 序列分析

將提取的菌株DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定,并將得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。對(duì)獲得的序列采用RAxML v. 7.2.6軟件進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析[21]。

1.6 致病性測(cè)試

采用針刺法接種。取無(wú)病條件下在營(yíng)養(yǎng)缽中栽培10 d,長(zhǎng)出3～4片真葉的高粱、小麥和大麥幼苗作為接種材料。用解剖刀從培養(yǎng)2周的病菌培養(yǎng)基上刮取分生孢子,用無(wú)菌水配制成5×107cfu/mL菌懸液,用無(wú)菌接種針輕刺真葉形成傷口,將一小塊脫脂棉蘸取菌懸液覆蓋于傷口處,同時(shí)用脫脂棉蘸取無(wú)菌水覆蓋于另一株植株的傷口處作為對(duì)照。接種后的幼苗用塑料薄膜保濕48 h后取出置于室溫下培養(yǎng),并觀察記錄發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病幼苗的病健交界組織進(jìn)行病菌的再分離。

表2 本研究所用的菌株和序列號(hào)1)

1) 新測(cè)菌株序列用粗體表示。 Newly generated sequences are indicated in bold. CBS: Central Bureau of fungal cultures, Utrecht, The Netherlands.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

在25℃培養(yǎng)條件下病變種子(圖1a)在PDA上所形成的疑似葡萄莖枯病菌菌落呈典型的圓形,氣生菌絲極其稀疏,形成大量黑色分生孢子器,易破裂,從中溢出大量分生孢子而使菌落呈玫瑰紅色或淡粉色,后期隨著暗色厚垣孢子的產(chǎn)生,菌落顏色逐漸變?yōu)殚蠙炀G色。菌株轉(zhuǎn)接以后仍呈規(guī)則圓形,產(chǎn)生大量氣生菌絲,呈致密的羊毛狀,也產(chǎn)生了極為豐富的分生孢子器及分生孢子,菌落顏色呈橄欖綠或灰綠色,背面呈深橄欖色或黑色,邊緣呈暗灰色(圖1c～e)。

將上述在PDA上分離獲得的疑似葡萄莖枯病菌進(jìn)行純化和編號(hào),編號(hào)為4358-17。該菌株在25℃條件下培養(yǎng),早期易產(chǎn)生近球形或洋梨形分生孢子器,直徑96～192 μm,多為單生,少數(shù)聚生。分生孢子從分生孢子器的孔口釋放,初期形成淺紅色黏孢團(tuán),逐漸變?yōu)殚蠙熳厣?。分生孢子大?5～9)μm×(1.8～3.6)μm,單胞,橢圓形至近圓柱形,有時(shí)略微彎曲,通常具兩個(gè)油滴,無(wú)色透明。厚垣孢子形狀和大小高度可變,磚格狀,串生成鏈或單生,大多數(shù)位于菌絲的末端或中間,不易從菌絲上脫落,顏色為深棕色至黑色,大小(32.6～44.6)μm×(11.5～19.7)μm(圖1f～m)。形態(tài)學(xué)研究表明分離菌株為葡萄莖枯病菌Didymellaglomerata。

2.2 序列分析

對(duì)菌株4358-17的DNA采用相應(yīng)的引物分別擴(kuò)增LSU、ITS、TUB2、ACT并進(jìn)行測(cè)序,將得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST。結(jié)果表明,菌株4358-17的LSU、ITS、TUB2、ACT序列與葡萄莖枯病菌(登錄號(hào)分別為KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896)相似性均為100%。進(jìn)一步通過(guò)多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)菌株4358-17與D.glomerata的代表菌株CBS 528.66聚集在一個(gè)分支上,支持率達(dá)到99%(圖2)。其他相近種和該菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上均能夠明顯區(qū)分開(kāi)。

圖1 高粱病變樣品及菌株4358-17的形態(tài)特征Fig.1 Symptoms and morphological characteristics of strain 4358-17

圖2 基于多位點(diǎn)(LSU、ITS、TUB2、ACT)系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建的菌株4358-17和相近物種的最大似然樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree inferred from a maximum likelihood analysis based on a concatenated alignment of LSU, ITS, TUB2 and ACT sequences of isolate 4358-17 and related Didymella spp.

2.3 致病性測(cè)定

運(yùn)用柯赫氏法則對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性測(cè)定,結(jié)果表明,接種4358-17并在室溫下培養(yǎng)4 d后,高粱幼苗葉片部位開(kāi)始變色,逐步變?yōu)闇\棕色,最后變?yōu)樯詈稚邏K,呈不規(guī)則形狀,用無(wú)菌水接種的對(duì)照葉片未出現(xiàn)發(fā)病癥狀(圖3a～b);小麥葉片在接種部位開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的淺黃色病斑,病斑逐漸擴(kuò)大,萎蔫干枯,變?yōu)闇\棕色。對(duì)照葉片無(wú)發(fā)病癥狀(圖3c～d)。大麥葉片接種后經(jīng)過(guò)連續(xù)10 d的觀察,發(fā)現(xiàn)其和對(duì)照葉片無(wú)明顯差異,因此本研究認(rèn)為菌株4358-17不容易侵染大麥。

圖3 菌株4358-17的致病性測(cè)試結(jié)果Fig.3 Pathogenicity test of strain 4358-17 inoculating sorghum and wheat

對(duì)上述接種植株的發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的再分離,所獲得的菌株與原始菌株4358-17菌落形狀、形態(tài)特征及序列分析結(jié)果均一致。

2.4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)高粱分離菌株4358-17的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)觀察、PCR產(chǎn)物序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析以及致病性測(cè)試,將菌株4358-17鑒定為葡萄莖枯病菌D.glomerata。

3 討論

對(duì)高粱上分離的菌株4358-17的形態(tài)學(xué)觀察和多位點(diǎn)(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列分析均表明該菌為葡萄莖枯病菌,致病性測(cè)試結(jié)果表明該菌能夠引起高粱和小麥的葉部感染。Corda[22]于1840年首次報(bào)道了葡萄莖枯病菌ConiothyriumglomeratumCorda。Wollenweber 和 Hochapfel[23]經(jīng)過(guò)進(jìn)一步深入的研究認(rèn)為葡萄莖枯病菌屬于莖點(diǎn)霉屬Phoma,現(xiàn)在的文獻(xiàn)報(bào)道多遵從該觀點(diǎn),采用Phomaglomerata(Corda) Wollenw. & Hochapfel作為葡萄莖枯病菌的種名。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,對(duì)植物病原真菌的分類更趨于自然。Chen等[24]依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果對(duì)莖點(diǎn)霉屬和相關(guān)屬的分類系統(tǒng)進(jìn)行了大幅度的調(diào)整,其中葡萄莖枯病菌被劃分到亞隔孢殼屬Didymella。本研究遵從該新分類系統(tǒng),采用更科學(xué)合理的種名Didymellaglomerata。

相對(duì)于檢測(cè),檢疫強(qiáng)調(diào)的是針對(duì)性和有效性,因此對(duì)送檢的樣品必須事先挑選病變的樣品進(jìn)行病原菌的分離;而檢測(cè)強(qiáng)調(diào)樣品的代表性和普通性,對(duì)送檢的樣品保證其均勻性,往往借助多次混勻和等分選取試驗(yàn)樣品。對(duì)于我國(guó)口岸進(jìn)口的大宗糧谷,要保證檢疫取樣有效性和針對(duì)性,必須在大量樣品中選取有典型癥狀的病變樣品。對(duì)于大豆、玉米、大麥等種子較大的樣品,病變樣品容易識(shí)別,但對(duì)高粱這類種子較小的糧食樣品,則肉眼不易辨別和選取。本研究經(jīng)過(guò)探索,采用谷物套篩組合篩選,將病變的種子和病殘?bào)w進(jìn)行富集,然后在解剖鏡下進(jìn)行甄別挑選,大大提高了病變樣品的篩選效率。目前,套篩組合篩選的方法已經(jīng)成功應(yīng)用于進(jìn)口油菜籽樣品中檢疫性病原菌—油菜莖基潰瘍病菌樣品的挑選,進(jìn)一步提高了其檢出率。

葡萄莖枯病菌在全世界廣泛分布,但是我國(guó)到目前為止只有兩例報(bào)道,因此該菌在我國(guó)口岸檢疫中具有重要意義。我國(guó)口岸多次從蘋(píng)果、大豆、豌豆、油橄欖等進(jìn)境農(nóng)產(chǎn)品中截獲該檢疫性真菌[25-26]。由于葡萄莖枯病菌以前沒(méi)有在高粱上引起田間發(fā)病的報(bào)道,因此該情況需要引起檢疫和植保人員的重視。本研究過(guò)程中致病性測(cè)試結(jié)果顯示該菌可侵染高粱,對(duì)高粱有潛在的危害性。中國(guó)已經(jīng)成為全球第一糧食進(jìn)口大國(guó),高粱是其中主要的進(jìn)口種類之一,其90%來(lái)自美國(guó)。高粱種子在裝卸、運(yùn)輸過(guò)程中易灑漏,因此該菌伴隨灑漏高粱種子傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)性極高。此次的葡萄莖枯病菌截獲表明從美國(guó)進(jìn)口高粱具有很大風(fēng)險(xiǎn),需保持警惕性,對(duì)來(lái)自疫區(qū)的高粱進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫監(jiān)控,以保護(hù)我國(guó)的生物安全。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification ofDidymellaglomerataon importedSorghumbicolor

Zhang Yu1, Xu Pingping2, Wu Jing2, Yang Jing1, Li Bin1, Wu Cuiping1

(1. Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China;2. Nanjing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China)

The isolate 4358-17 was obtained from importedSorghumbicolorfrom America. It was similar toDidymellaglomeratain morphology. BLAST analysis indicated that LSU, ITS, TUB2 and ACT sequence showed 100% identity with the sequences with accession numbers of KT389718, FJ427004, FJ427115 and FJ426896, respectively. Phylogenetic analysis revealed that the isolate 4358-17 clustered withinD.glomeratastrains. Pathogenicity test showed that it could cause leaf spot on sorghum and wheat 4 d after inoculation. Based on all above results, the isolate 4358-17 was identified asD.glomerata.

Didymellaglomerata; morphological characters; phylogenetic analysis; pathogenicity test

2016-08-01

2016-09-27

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃(2012IK278);“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAK11B03)

S 435.14

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.033

* 通信作者 E-mail:wucp@jsciq.gov.cn