培哚普利對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠認(rèn)知功能的改善及腦中NOS的影響①

張騰騰，辛 華， 黃作義 ，鄒春穎 ，張淑萍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

培哚普利對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠認(rèn)知功能的改善及腦中NOS的影響①

張騰騰，辛 華， 黃作義 ，鄒春穎 ，張淑萍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察培哚普利對(duì)APPswe/PS1dE9癡呆模型小鼠認(rèn)知功能的改善及腦中一氧化氮合酶(NOS)的影響。方法：將30只健康A(chǔ)PPswe/PS1dE9 4月齡雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠隨機(jī)分為3組：即模型組(AD組)、培哚普利治療組、石杉?jí)A甲治療組。另外選擇10只健康4月齡野生雄性小鼠作為正常組。灌藥4個(gè)月以后，觀察小鼠一般狀態(tài)，Morris 水迷宮觀察小鼠行為學(xué)，化試劑盒檢測(cè)小鼠海馬中iNOS和nNOS含量。結(jié)果：與石杉?jí)A甲治療組相比，培哚普利治療組能夠明顯改善APPswe/PS1dE9癡呆小鼠的認(rèn)知功能，并且能夠降低小鼠海馬組織中iNOS、nNOS的含量。結(jié)論：培哚普利能夠明顯提高APPswe/PS1dE9癡呆小鼠的認(rèn)知能力，同時(shí)降低小鼠海馬組織中iNOS及nNOS的含量。

阿爾茲海默病(AD)；培哚普利；一氧化氮合酶

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)[1]是發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害、人格和行為改變等。培哚普利是ACEI類藥物中的一種，除傳統(tǒng)的血壓調(diào)節(jié)、水鹽代謝、垂體激素分泌等生理功能外，對(duì)于神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能也有重要作用[2，3]，目前許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明其可以通過血腦屏障產(chǎn)生中樞性作用[4]，本研究著重分析培哚普利對(duì)老年癡呆小鼠認(rèn)知功能的改善及對(duì)小鼠海馬區(qū)NOS(iNOS、nNOS)水平的影響，為以后老年癡呆的預(yù)防及治療提供新道路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取4月齡APPswe/PS1dE9癡呆小鼠30只及4月齡野生雄性小鼠10只。APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所(該品系引種于美國(guó)JACKSON實(shí)驗(yàn)室)，4月齡野生雄性小鼠由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。全程小鼠自由攝食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)及所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守佳木斯大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥品試劑與儀器

培哚普利片購自武漢能仁醫(yī)藥化工有限公司，石杉?jí)A甲片購自上海復(fù)旦復(fù)華科技有限公司，iNOS、nNOS試劑盒購自上海滬震生物有限公司，標(biāo)準(zhǔn)型腦立體定向儀購自深圳市瑞沃德(RWD)生命科技有限公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型

將30只4月齡APPswe/PS1dE9癡呆小鼠隨機(jī)分為模型組、培哚普利組(1mg/kg·d)、石杉?jí)A甲組(0.3mg /kg·d)[5]，另選擇同等數(shù)量的健康野生4月齡雄性小鼠作為正常組。模型組及正常組給予等體積生理鹽水灌胃。每日灌藥 1次,連續(xù) 4個(gè)月。

1.4 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試

各組小鼠在末次給藥后次日進(jìn)行 Morris 水迷宮探求小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。恒溫游泳池直徑110cm，高50cm，深30cm，池壁周圍涂上黑漆，將池壁分為四個(gè)象限，選取任意象限，在該象限放一直徑8cm，高20cm的白色小鼠站臺(tái)，測(cè)試前使水溫保持25℃，水內(nèi)放入牛奶混勻。將小鼠分別從4個(gè)不同象限面壁入水，記錄小鼠在60s內(nèi)尋找平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)。若時(shí)間超過60s，則指導(dǎo)動(dòng)物到平臺(tái)并停留10s，此時(shí)潛伏期記為60s。以4個(gè)不同象限的平均值作為該次的逃避潛伏期，記錄小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。測(cè)試歷時(shí)5d，每天訓(xùn)練一次。同理移去原平臺(tái)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)及在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間，記錄小鼠對(duì)原平臺(tái)的空間記憶情況。

1.5 腦組織NOS含量測(cè)定

Morris水迷宮測(cè)試后采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其放置在標(biāo)準(zhǔn)型腦立體定位儀上，仔細(xì)分離出海馬,依據(jù)試劑盒要求處理小鼠海馬組織，測(cè)定其中iNOS和nNOS含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 培哚普利對(duì)癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

見表1～2。

表1 各組小鼠逃避潛伏期的比較±s)

注：與正常組相比，**P<0.05，*P<0.05;與模型組相比，△△P<0. 01，△P<0.05。

從表1可知，與正常組比較，模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠的逃避潛伏期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.1)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)組的潛伏期不斷縮短，表明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)障礙。各治療組與模型組比較，潛伏期均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明培哚普利組與石杉?jí)A甲組均能使小鼠逃避潛伏期縮短，但二者效果相當(dāng)，沒有明顯差別。

表2 各組小鼠原平臺(tái)穿越次數(shù)和象限停留 時(shí)間比較

注：與正常組相比，＊＊P<0.01，*P<0. 05;與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

由表2可知，與正常對(duì)照組比較，模型組原平臺(tái)象限停留時(shí)間及穿越次數(shù)明顯減小，并且呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，表明雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，表現(xiàn)為一定的癡呆癥狀。與模型組相比，石杉?jí)A甲組與培哚普利組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但培哚普利組小鼠原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，原平臺(tái)穿越次數(shù)顯著增多，即培哚普利組效果更顯著(P<0.01)。

2.2 培哚普利對(duì)癡呆小鼠大腦海馬內(nèi)iNOS及nNOS的影響

見表3。

表3 各組小鼠大腦海馬內(nèi)iNOS及nNOS的含量

注： 與正常組相比，＊＊P<0.01，*P<0.05;與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

從表3可知，模型組與正常組比較腦組織iNOS和nNOS含量均顯著增加，說明癡呆小鼠腦組織中iNOS和nNOS表達(dá)水平升高，從而造成神經(jīng)細(xì)胞死亡。與模型組相比，兩治療組中iNOS和nNOS含量均降低，但培哚普利組更明顯(P<0.01)，說明兩組藥均能減輕iNOS和nNOS對(duì)大腦的損害，但培哚普利效果更好。

3 討論

腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin-aangiotensin-system,RAS)對(duì)人體的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)有重要作用。腎素在血管緊張素原的作用下生成血管緊張素I(AngI)，AngI在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的作用下，生成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)。AngⅡ有兩個(gè)受體: 血管緊張素受體1(AT1R) 和血管緊張素受體2(AT2R) 。AngⅡ主要作用于AT1R，可以導(dǎo)致血管收縮和內(nèi)皮功能紊亂[6]，并產(chǎn)生氧化應(yīng)激而損害腦血管功能[7]。ACEI類藥物主要抑制ACE，使AngⅡ的合成減少，從而減輕其對(duì)腦組織和神經(jīng)元的破壞。有資料表明[8]，能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血ACEI類藥物如卡托普利、福辛普利、賴諾普利、培哚普利、雷米普利等能通過血腦屏障，有效防止癡呆, 控制并減少氧化應(yīng)激, 減輕腦組織炎癥。本文通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠逃避潛伏期、小鼠空間探索試驗(yàn)的原平臺(tái)穿越次數(shù)、象限停留時(shí)間。證實(shí)，在使用中樞性ACEI類藥物培哚普利后，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯得到改善。

一氧化氮(nitricoxide,NO)是體內(nèi)重要的信使分子，在體內(nèi)由L- 精氨酸在一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase，NOS)的催化作用下生成。NOS有三種亞型[9]:即神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)[10]。其中，nNOS和eNOS在生理?xiàng)l件下可正常表達(dá)，而iNOS在生理?xiàng)l件下不表達(dá)，只在病理?xiàng)l件下誘導(dǎo)表達(dá),激活后會(huì)長(zhǎng)時(shí)間大量合成NO。由于NO性質(zhì)不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)條件下能檢測(cè)到極少的含量，而NO的多少與NOS的活性呈正相關(guān)，固本實(shí)驗(yàn)對(duì)iNOS、nNOS的含量進(jìn)行了檢測(cè)，從而間接說明NO對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠大腦中iNOS和nNOS均明顯升高，表明炎癥性刺激使iNOS和nNOS過度表達(dá)，使體內(nèi)生成的NO增多，產(chǎn)生神經(jīng)毒性；對(duì)其一般行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠喜蜷臥，實(shí)驗(yàn)人員敲擊鼠柵欄不予理睬，對(duì)氣味及食物反應(yīng)遲鈍，并且在Morris水迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)出逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，原平臺(tái)穿越次數(shù)和原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著縮短。猜測(cè)其機(jī)制可能為nNOS及iNOS激活產(chǎn)生的NO，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)通向細(xì)胞死亡的最后共同通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致血管收縮，內(nèi)皮細(xì)胞紊亂，從而使小鼠學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙。而在使用培哚普利進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠反應(yīng)變得敏捷，一有聲音即睜眼, 跑到柵欄張望, 在聞到食物香味時(shí)， 鼻腔作嗅物狀。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果也出現(xiàn)巨大反差，即小鼠平臺(tái)逃避潛伏期縮短，原平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間增多；同時(shí)發(fā)現(xiàn)癡呆小鼠腦中iNOS和nNOS含量均顯著降低，推斷培哚普利能通過小鼠的血腦屏障，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用，使血管緊張素Ⅱ生成減少，使其對(duì)AT1R受體的作用減弱，增加腦血流灌注，有對(duì)抗氧化應(yīng)激，保護(hù)腦血管功能，有利于神經(jīng)細(xì)胞分化、再生和存活，誘導(dǎo)神經(jīng)元分化以及軸突生長(zhǎng)，有利于損傷神經(jīng)的功能修復(fù)，從而改善認(rèn)知功能。

綜上所述，培哚普利對(duì)APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠有顯著的防治效果，能夠抑制iNOS和nNOS的合成，從而降低腦組織NO的產(chǎn)生，提高小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)識(shí)能力，從而為今后老年癡呆的預(yù)防提供新的思路。

[1]楊立娟,姚艷英.社區(qū)老年癡呆的早期觀察及護(hù)理對(duì)策[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006,29(6):86

[2]KerrDS，BevilaquaLR，BoniniJS，etal．AngiotensinIIblocksmemoryconsolidationthroughanAT2receptor-dependentmechanism[J].Psy-chopharmacology，2005，179(3):529-535

[3]DeBundelD，DemaegdtH，LahoutteT，etal．InvolvementoftheAT1re-ceptorsubtypeintheeffectsofangiotensinⅣandLVV-haemorphin7onhippocampalneurotransmitterlevelsandspatialworkingmemory[J].JNeurochem，2010，112(5):1223-1234

[4]OhruiT，TomitaN，Sato-NakagawaT，etal．EffectsofbrainpenetratingACEinhibitorsonAlzheimerdiseaseprogression[J].Neurology，2004，63(7):1324-1330

[5]楊春榮,鄭素芹.離心超濾法測(cè)定石杉?jí)A甲固體脂質(zhì)納米粒的包封率[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(3):752

[6]張淑萍,王昆祥.社區(qū)老年癡呆的早期觀察及護(hù)理對(duì)策[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,33(5):33

[7]王瑩，邊迪.血管性癡呆藥物治療最新進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(4):107-108

[8]YamadaK，UcjodaS，TakahashiS，etal.Effectofacentrallyactiveangiotensin-convertingenzymeinhibitorperindopriloncognitiveperformanceinamousemodelofAlzheimer'sdisease[J].BrainRes， 2010，1352:176-186

[9]SamdsniAF,DawsonTM,DawonVL.Nitricoxidesynthaseinmodelsoffocalischemia[J].Stroke,1997,28:1283-1284

[10]RahHC，JeonYJ，LeeWS，etal.Associationofnitricoxidesynthasegenepolymorphisms( -786T>C，4a4b，894G>T)withprimaryovarianinsufficiencyinKoreanwomen[J].Maturitas，2013,74(2):160-165

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：C2012-42。

張騰騰(1988～)女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

張淑萍(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E -mail:blcldxn@163.com。

R742

B

1008-0104(2017)02-0025-02

2017-01-05)