阻斷劑對(duì)三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的影響

蔡文杰，湯華成，溫丹旭

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

阻斷劑對(duì)三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的影響

蔡文杰，湯華成，溫丹旭

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

為選取高效安全的阻斷劑，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)比試驗(yàn)方法，首次選擇茉莉茶茶渣、茶堿和煙酰胺三種阻斷劑，研究其對(duì)三孢布拉霉（Blakeslea trispora）代謝合成番茄紅素、β-胡蘿卜素合成量和菌體生物量的影響，并進(jìn)一步優(yōu)化茶葉阻斷劑促產(chǎn)番茄紅素條件。研究結(jié)果表明：茶渣、茶堿、煙酰胺均可促進(jìn)三孢布拉霉累積番茄紅素。研究結(jié)果表明發(fā)酵40 h加入9 g·L-1茶堿、8 g·L-1茶葉、6 g·L-1煙酰胺時(shí)，番茄紅素的合成量分別是36.32、158.38、34.69 mg·L-1，β-胡蘿卜素的含量分別是33.25、42.07、31.79 mg·L-1，菌體生物量分別是24.69、38.53、27.40 mg·L-1。其中以茶渣阻斷番茄紅素環(huán)化成β-胡蘿卜素效果最佳，對(duì)其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的茶渣最佳加入時(shí)間為48 h，最佳加入量為9 g·L-1時(shí)，番茄紅素生物合成量可達(dá)到205.49 mg·L-1。研究結(jié)果為探索通過(guò)阻斷番茄紅素轉(zhuǎn)化為胡蘿卜素代謝路徑提供了理論參考。

三孢布拉霉菌；阻斷劑；番茄紅素；茶渣

番茄紅素具有清除自由基、預(yù)防多種癌癥、保護(hù)心血管、抗老化、保護(hù)皮膚、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能，已成為一種非常重要的類胡蘿卜素并廣泛應(yīng)用[1]。已報(bào)道的番茄紅素生產(chǎn)主要有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、天然植物提取法和基因工程法等，微生物發(fā)酵法由于其發(fā)酵周期短、可操作性強(qiáng)、成本低、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛認(rèn)可，成為研究熱點(diǎn)[2]。三孢布拉霉是目前可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的唯一一種產(chǎn)番茄紅素菌株，通過(guò)番茄紅素環(huán)化酶抑制劑阻斷番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素路徑實(shí)現(xiàn)番茄紅素的大量累積[3]。三孢布拉霉產(chǎn)番茄紅素的途徑是由八氫番茄紅素經(jīng)過(guò)脫氫反應(yīng)生成的，有兩種酶系參與完成脫氫反應(yīng)。番茄紅素經(jīng)脫氫反應(yīng)后，會(huì)在番茄紅素環(huán)化酶的作用下發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成β-胡蘿卜素。要想獲得更高的番茄紅素的生物合成量，就必須使番茄紅素環(huán)化酶失去活行，阻斷番茄紅素環(huán)化成β-胡蘿卜素，所以研究高效、低毒的阻斷劑是至關(guān)重要的[4]。

這些抑制劑主要由兩類物質(zhì)組成，一類是叔胺類化合物，如三乙胺、3-二甲基-1-丙醇；另一類是含氮的雜環(huán)類化合物，比如吡啶、咪唑、哌啶及其衍生物均具有阻斷番茄紅素環(huán)化反應(yīng)的作用[5]。為了提高三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的含量，研究考察了茶葉、茶堿、煙酰胺三種物質(zhì)，探究其對(duì)三孢布拉霉發(fā)酵的影響。在茶樹(shù)體中，主要含有兩大類生物堿：一類是嘌呤類生物堿，另一類是少量的嘧啶類生物堿。茶葉中已發(fā)現(xiàn)的嘌呤類生物堿有：腺嘌呤、烏嘌呤、黃嘌呤等，其特點(diǎn)均是以嘌呤環(huán)為基本骨架的含氮雜環(huán)類化合物[6]。少數(shù)的嘧碇類生物堿有：尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。茶葉所包含的生物堿中，含量最多的是咖啡堿、可可堿、茶堿，這三種生物堿均屬于含氮雜環(huán)類化合物[7]。煙酰胺的主要組成成分是3-吡啶甲酰胺，是一種含氮的六元雜環(huán)，屬于吡啶類衍生物的一種。茉莉茶（茶葉及茶莖）、茶堿和煙酰胺等作為番茄紅素環(huán)化酶抑制劑，為促進(jìn)三孢布拉霉產(chǎn)番茄紅素提供了原料和分子基礎(chǔ)。

試驗(yàn)研究茶渣、茶堿、煙酰胺對(duì)于三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的影響，探索控制發(fā)酵過(guò)程中阻遏番茄紅素環(huán)化反應(yīng)進(jìn)而提高番茄紅素產(chǎn)量，可為番茄紅素大量生產(chǎn)提供理論參考。

1 試劑、儀器和方法

1.1 主要試劑和材料

KH2PO4、MgSO4、VB1、氫氧化鈉、石油醚、無(wú)水乙醇均為分析純。番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于阿拉丁試劑公司。生理鹽水、茉莉茶均為市售。三孢布拉霉菌（產(chǎn)β-胡蘿卜素，（+）菌）AF97006，三孢布拉霉菌（產(chǎn)β-胡蘿卜素，（-）菌）AF96002，均購(gòu)自于武漢大學(xué)菌種保藏中心。

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；立式高壓蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；真空干燥箱，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；722型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；超凈工作臺(tái)，北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備工程公司；光學(xué)顯微鏡，南京麥迪森儀器有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 研究方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，三孢布拉霉正、負(fù)菌分別接種至斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5 d。

種子培養(yǎng)基：玉米淀粉30 g·L-1，大豆粉（黃豆粉）50 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，VB10.02 g·L-1，pH 6.5，121℃條件下滅菌20 min備用[8]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉50 g·L-1，大豆粉（黃豆粉）25 g·L-1，大豆油40 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，Mg－SO40.5 g·L-1，VB10.02 g·L-1，pH 6.5（調(diào)到6.7，滅菌后會(huì)降0.2），121℃條件下滅菌20 min備用[8]。

1.3.2 培養(yǎng)條件

（1）種子培養(yǎng)：在無(wú)菌的操作條件下，將孢子懸浮液接種到種子培養(yǎng)基中，正負(fù)菌孢子接種量均1×105個(gè)·mL-1，接種量4%，250 mL錐形瓶中加50 mL培養(yǎng)基。200 r·min-1，25℃培養(yǎng)。種子培養(yǎng)采用非同步培養(yǎng)，負(fù)菌先進(jìn)行種子培養(yǎng)，12 h后正菌進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h。即負(fù)菌培養(yǎng)48 h，正菌培養(yǎng)36 h。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)采用正負(fù)菌非同步混合發(fā)酵，即將生長(zhǎng)旺盛的種齡48 h的負(fù)菌和36 h的正菌按照4∶1的比例進(jìn)行發(fā)酵，即負(fù)菌接種量為8%（v/v）正菌接種量為2%（v/v），250 mL錐形瓶中加50 mL培養(yǎng)基，采用10 mL的一次性消毒注射器進(jìn)行轉(zhuǎn)移菌液。200 r·min-1，25℃培養(yǎng)120 h。以不加阻斷劑的空白組為對(duì)照，茉莉茶茶葉研磨成茶渣后采取高溫滅菌（121℃，20 min）后直接加入到培養(yǎng)基中，茶堿和煙酰胺溶于水后，使用微孔濾膜過(guò)濾后加入培養(yǎng)基中。

1.3.3 孢子懸浮液的制備

吸取已滅菌的生理鹽水3 mL，反復(fù)抽吸沖洗試管斜面3 min，將菌液收集到離心管內(nèi)，即制得未知濃度的孢子懸浮液。過(guò)濾后混勻孢子懸浮液，取樣用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，控制孢子數(shù)106個(gè)·mL-1左右。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體生物量的測(cè)量

發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)3 500 r·min-1離心12 min，取清液，加入蒸餾水將離心管底部沉淀的菌體重新懸起來(lái)，再以3 500 r·min-1的速度離心12 min。重復(fù)上一步驟兩次，離心后的菌絲體放在真空干燥箱內(nèi)45℃條件下進(jìn)行干燥3 h，恒重后稱重。1.4.2番茄紅素含量及β-胡蘿卜素的測(cè)定

番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線及β-胡蘿卜素曲線的繪制：準(zhǔn)確并避光稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品）100 mg，加入10 mL石油醚震蕩、混勻并充分溶解，用石油醚定容至50 mL。定容后番茄紅素（β-胡蘿卜素）的濃度為2 mg·mL-1，分取此濃度番茄紅素（β-胡蘿卜素）標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1、2、3、4、5 mL用石油醚稀釋至5 mL，稀釋后番茄紅素（β-胡蘿卜素）標(biāo)準(zhǔn)液最終濃度分別為：0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg·mL-1。將稀釋液分別在波長(zhǎng)472（450）nm處測(cè)其吸光值，以番茄紅素（β-胡蘿卜素）標(biāo)準(zhǔn)液濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光值作為縱坐標(biāo)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

樣品番茄紅素（β-胡蘿卜素）含量的計(jì)算公式如下：

式中：C—標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得或由回歸方程算出樣品

中溶液濃度，mg·mL-1；

D—萃取液的稀釋倍數(shù)；

m—萃取所用的干菌體樣品質(zhì)量，g；

V—定容的石油醚體積，mL；

G—菌體生物量，g·L-1。

番茄紅素（β-胡蘿卜素）含量的測(cè)定方法：把真空干燥過(guò)的菌絲體用液氮進(jìn)行研磨，研磨三次破壁后加入石油醚提取，抽提15 min至無(wú)色，將抽提的抽提液定容至5 mL（其顏色深淺程度與番茄紅素或β-胡蘿卜素的含量成正比關(guān)系），在472 nm（450 nm）處測(cè)量OD值，平行測(cè)定三次，分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程根據(jù)公式計(jì)算出番茄紅素的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SAS8.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 阻斷劑不同添加量對(duì)發(fā)酵番茄紅素的影響

研究表明，阻斷劑的加入對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的毒害作用，過(guò)早加入阻斷劑對(duì)菌體生理代謝有明顯的毒害作用，不利于菌體生長(zhǎng)，過(guò)晚加入阻斷劑會(huì)使阻斷效果會(huì)大大減弱[9]。所以本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵40 h分別加入茶渣、茶堿和煙酰胺，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定各種阻斷劑的添加量，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，單因素實(shí)驗(yàn)阻斷結(jié)果如下：

表1 不同阻斷劑對(duì)番茄紅素及β-胡蘿卜素生物合成量的影響Table 1Effect of different blocking agents on the biosynthesis of lycopene and β-carotene

研究以茶渣、茶堿和煙酰胺作為三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的抑制劑，以不添加任何物質(zhì)的組別作為空白對(duì)照，研究代謝過(guò)程中，抑制劑對(duì)環(huán)化反應(yīng)的影響。于發(fā)酵40 h加入抑制劑，抑制結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)表明茶葉、茶堿、煙酰胺都可以抑制番茄紅素的環(huán)化反應(yīng)，從而使番茄紅素的生物合成量增加；β-胡蘿卜的合成被部分阻斷，使其生物合成量減少。

茶堿作為抑制劑，添加量為9 g·L-1時(shí)抑制效果最好。菌體生物量降為24.69 g·L-1（僅為對(duì)照組的77%），這是由于茶堿對(duì)菌體有毒害作用，使菌體少量死亡，番茄紅素生物合成量最高可達(dá)到36.32 mg·L-1（合成量是對(duì)照組的4.5倍），β-胡蘿卜生物合成量將為33.25 mg·L-1（合成量為對(duì)照組的30%）。茶渣作為抑制劑，添加量為8 g·L-1時(shí)抑制效果最好。菌體生物量增加到38.53 g·L-1（比對(duì)照組增加了21%），這是由于茶葉中含有多種碳水化合物、維生素、多元酚類可溶解于培養(yǎng)基中，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。番茄紅素生物合成量最高可達(dá)到158.38 mg·L-1（合成量是對(duì)照組的16.7倍），β-胡蘿卜生物合成量將為42.07 mg·L-1（合成量為對(duì)照組的38%），抑制效果最好。煙酰胺作為抑制劑對(duì)菌體也有一定的毒害作用，使菌體生物量不斷下降。番茄紅素生物合成量最高可達(dá)到34.69 mg·L-1（合成量是對(duì)照組的3.6倍），β-胡蘿卜生物合成量將為31.79 mg·L-1（合成量為對(duì)照組的31%），抑制效果較好。茶葉的加入既使得菌體增加又能很好的阻斷β-胡蘿卜的合成。因此，研究將茉莉茶茶渣作為阻斷劑考察不同添加時(shí)間和添加量對(duì)番茄紅素生物合成量的影響。

2.2 茶渣作為阻斷劑加入時(shí)間及加入量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響

表2 不同加入時(shí)間及加入量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響Table 2Effect of different adding time and dosage on lycopene production

對(duì)茶渣作為阻斷劑的添加時(shí)間和添加量進(jìn)一步進(jìn)行探究，如表2所示。結(jié)果表明，隨著添加時(shí)間從36 h增加到52 h，番茄紅素生物合成量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。同時(shí)，隨著添加量從6 g·L-1增加到10 g·L-1，番茄紅素生物合成量也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。

過(guò)早的添加阻斷劑或者加大添加量抑制β-胡蘿卜素的合成，不僅抑制菌體的生長(zhǎng)，而且也不有利于番茄紅素的積累。因?yàn)槿咚嵩诎l(fā)酵過(guò)程中，主要起到性激素的作用，可以大量促進(jìn)類胡蘿卜素的合成，β-胡蘿卜素又是三孢酸的前體物質(zhì)。因此過(guò)量的加入抑制劑會(huì)導(dǎo)致三孢酸的合成受阻，從而導(dǎo)致類胡蘿卜素的產(chǎn)量下降。過(guò)晚的添加阻斷劑或者添加量不足將會(huì)導(dǎo)致β-胡蘿卜素大量積累，不能及時(shí)阻斷番茄紅素的環(huán)化反應(yīng)使其產(chǎn)量降低[10]。因此，在發(fā)酵48 h時(shí)添加9 g·L-1的茶葉可以獲得最佳的阻斷效果，番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)205.49 mg·L-1。修宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，以煙草作為抑制劑的樣品番茄紅素產(chǎn)量更可達(dá)170 mg·L-1，而且繼續(xù)增加煙草添加量會(huì)降低各種類胡蘿卜素的產(chǎn)量，直至菌體死亡。研究發(fā)現(xiàn)同樣作為固形物加入培養(yǎng)架中的茶葉也能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，且對(duì)番茄紅素環(huán)化酶環(huán)化作用的效果好于煙草。原因一是加入茶葉作為固形物在震蕩培養(yǎng)時(shí)，可提高發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基中氧的傳遞，增加錐形瓶中溶解氧濃度，使菌體生長(zhǎng)更旺盛；原因二是茶葉中含有多種碳水化合物、維生素、多元酚類可溶解于培養(yǎng)基中，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)[11]。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在發(fā)酵過(guò)程中添加各種含氮雜環(huán)的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑茶葉、茶堿、煙酰胺都可以抑制番茄紅素的環(huán)化反應(yīng)，均可促進(jìn)三孢布拉霉累積番茄紅素，其中茶葉效果更優(yōu)。結(jié)果表明，在發(fā)酵48 h時(shí)添加9 g·L-1的茶葉，番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)205.49 mg·L-1，不加任何阻斷劑時(shí)番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)9 mg·L-1，增幅達(dá)23倍。可見(jiàn)阻斷劑在獲得高產(chǎn)量番茄紅素上有重要的作用，獲得更高效、安全的抑制劑是三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的研究重點(diǎn)。

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Effect of Inhibitors on the Lycopene Production from Blakeslea trispora

Cai Wenjie，Tang Huacheng，Wen Danxu
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to select the high efficient and safe blocking agent，comparative test method was used to study Blakeslea trispora metabolic synthesis of lycopene，beta-carotene and bacteria amount of biomass，choose the tea-leaf of jasmine tea，theophylline and nicotinamide as the inhibitors，and further the conditions that tea as a blocker produce lycopene were optimized.The results showed that：tea-leaf of jasmine tea，theophylline，nicotinamide could promote Blakeslea trispora to accumulates lycopene.After 40 h of fermentation adding 9 g·L-1theophylline，8 g·L-1tea-leaf of jasmine tea，6 g·L-1nicotinamide，lycopene synthesis were 36.32 mg·L-1，158.38 mg·L-1，34.69 mg·L-1，respectively.The beta carotene contents were 33.25 mg·L-1，42.07 mg·L-1，31.79 mg·L-1，Bacteria biomass was 24.69 mg·L-1，38.53 mg·L-1，27.40 mg·L-1.In which tea-leaf of jasmine tea was the best inhibitor，the further experiments showed that the best adding time was 48 h，optimum adding quantity was 9 g·L-1，lycopene biosynthesis could reach 205.49 mg·L-1.The research results provided a theoretical reference for the study of the metabolic pathway of the lycopene into carotene.

Blakeslea trispora，inhibitor；Lycopene；tea-leaf of jasmine tea

Q78

A

1002-2090（2017）03-0045-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.010

2016-03-18

三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的最佳條件的篩選（GZ11B401）。

蔡文杰（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

湯華成，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：byndthc@126.com。