環(huán)境UV—B輻射增強對葉用杜仲林葉片光合作用與活性物質含量的影響

付金穎 楊超 李德文 唐中華 郭曉瑞 祖元剛

摘要[目的]探討環(huán)境紫外（UV-B）輻射對葉用杜仲葉片光合作用和活性物質含量及膜脂過氧化的影響，為葉用杜仲林的生態(tài)培育提供理論依據(jù)。[方法]在不同紫外（UV-B）輻射強度處理[CK：+0；T1：+1.40 kJ/（m2·d）；T2：+2.81 kJ/（m2·d）]下，以5年生杜仲為研究對象，采用單因素方差分析與相關分析方法研究凈光合速率、光合色素、次生代謝產(chǎn)物及自由基含量差異及相關性。[結果]UV-B輻射強度增加顯著降低杜仲葉片光合參數(shù)凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）和葉綠素a/b，顯著提高了葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量，T1處理的葉綠素含量最高[（1.15±0.049）mg/g]，T2處理的類胡蘿卜含量最高[（0.036 0±0.001 6） mg/g]；UV-B輻射強度增加顯著降低杜仲葉片部分次生代謝產(chǎn)物桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平苷和綠原酸含量，且最大變化值之間分別相差20.74、61.23、16.16和13.63倍，同時也顯著提高了部分次生代謝產(chǎn)物京尼平、黃酮、總酚和單寧含量，且T1處理的京尼平、黃酮、總酚和單寧含量分別是CK處理的1.21、1.11、1.34和1.37倍，總酚與單寧含量以T2處理最高，分別為（1.290 0±0.023 0）和（17.30±1.44）μg/g；UV-B輻射增強顯著增加了MDA、H2O2和O2·-含量，且T1處理的MDA含量與O2·-含量較CK處理組分別高39.46%、70.48%；T2處理的H2O2含量較CK處理組高43.51%。[結論]UV-B輻射顯著影響杜仲葉片光合參數(shù)及綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸等主要活性物質含量，因此可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境UV-B輻射強度以提高葉用杜仲林的經(jīng)濟效益。

關鍵詞杜仲；UV-B輻射；凈光合速率；茶多酚；綠原酸

中圖分類號S567；Q945.11文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）26-0006-05

Effects of Elevated UVB Radiation on Photosynthesis and Contents of Active Substance of Eucommia ulmoides Plantation

FU Jinying，YANG Chao，LI Dewen* et al（Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] The aim was to study the effects of environmental ultraviolet （UVB） radiation on the photosynthesis，active substance content and membrane lipid peroxidation of leaves of Eucommia ulmoides and provide theoretical basis for the ecological cultivation of Eucommia ulmoides.[Method] Taking five years old Eucommia ulmoides leaves under different ultraviolet radiation treatments [CK：+0； T1：+1.40 kJ/（m2·d）； T2：+2.81 kJ/（m2·d）] as materials，with the single factor analysis of variance and correlation analysis method were used to study the variation content of photosynthetic parameters，photosynthetic pigment，aucubin，chlorogenic acid，genipin，geniposide，geniposide acid，flavonoids，total phenol，tannin and MDA，H2O2，O2·-.[Result] Elevated UVB radiation significantly reduced the photosynthetic rate （Pn），stomatal conductance （Gs），intercellular CO2 concentration （Ci），transpiration rate （Tr） and chlorophyll a/b，and increased the content of chlorophyll a，chlorophyll b，carotenoid and total chlorophyll significantly； the content of total chlorophyll in T1 treatment was the highest [（1.15±0.049） mg/g]；the content of carotenoid in T2 treatment was the highest [（0.036 0±0.001 6） mg/g]； UVB radiation significantly reduced the partial metabolites such as aucubin，geniposide acid，geniposide and chlorogenic acid content in the leaves of Eucommia ulmoides，and the maximum change was 20.74 times，61.23 times，16.16 times and 13.63 times，respectively，and other secondary metabolites，genipin，flavonoids，total phenolics and tannin content were significantly increased.The contents of total phenol and tannin in T1 treatment were 1.21 times，1.11 times，1.34 times and 1.37 times higher than that of CK treatment，respectively，and the contents of total phenol and tannin were （1.290 0±0.023 0） and （17.30±1.44） μg/g respectively in T2 treatment.UVB radiation significantly increased the contents of MDA，H2O2 and O2·-，the content of MDA and O2·- in T2 treatment was 39.46% and 70.48% higher than that in CK treatment group.The content of H2O2 in T2 treatment was 43.51% higher than CK treatment group.[Conclusion] UVB radiation significantly affects the photosynthetic parameters of Eucommia ulmoides leaves and the main active substances such as chlorogenic acid，aucubin，geniposide and geniposide，so the UVB radiation intensity can be used to improve the economic benefit of Eucommia ulmoides.

Key wordsEucommia ulmoides Oliv；UVB radiation；Net photosynthetic rate；Tea polyphenol；Chlorogenic acid

大氣層中平流層臭氧減薄受到國際社會的普遍關注，UV-B輻射部分被臭氧吸收，波長越短，臭氧對其吸收量越大，因而臭氧層的減薄主要引起地表 UV-B輻射增強。UV-B輻射的增強勢必影響植物的生長發(fā)育，Rozema等[1]也認為 UV-B輻射誘導產(chǎn)生的次生代謝物如黃酮、單寧和木質素等的變化對生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)循環(huán)的調(diào)節(jié)才是其最重要的影響。許多植物次生代謝產(chǎn)物可作為重要的醫(yī)藥和化工原料，植物次生代謝過程與環(huán)境關系的研究有利于提高資源植物生物工程的效率和質量，也有助于傳統(tǒng)中藥植物的目標化種植[2]。植物次生代謝物中有效成分含量的多寡往往是決定中藥材質量的關鍵所在，為提高藥材質量，利用環(huán)境因子對藥用植物的生長進行干擾從而調(diào)控其代謝途徑，已成為目前植物學研究的熱點。

植物暴露于UV-B輻射后，主要被葉片表皮吸收，表皮層通過積累具有吸收紫外線功能的化合物適應環(huán)境變化[3]。當前研究紫外輻射對次生代謝產(chǎn)物的變化主要集中在類黃酮次生物質方面。Fischbach等[4]發(fā)現(xiàn)UV-B輻射誘導Piceaabies 樹葉表皮組織中的類黃酮和羥基肉桂酸積累，類黃酮的積累降低了UV-B輻射對表皮層的透過率[5]。 UV-B 輻射誘導植物類黃酮累積的分子生物學機理是它能刺激類黃酮生物合成途徑中關鍵酶基因的轉錄和表達，Park等[6]發(fā)現(xiàn)苯丙素合成基因途徑中相關酶（PAL、CHS、CHI和DFR）活性表達在S-UV-B處理下與黃酮含量的變化同步升高，說明相關合成途徑上的酶對黃酮在S-UV-B下起到關鍵作用；Beggs等[7]發(fā)現(xiàn)類黃酮合成途徑的苯丙氨酸裂解酶和查爾酮合成酶以及其他分支點的酶在UV-B輻射下活性加強，引起植物體內(nèi)類黃酮及酚醛類化合物 （丹寧、木質素等 ）的增加[8]。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）是我國名貴的滋補藥材，一直以來杜仲主要以杜仲皮入藥，但現(xiàn)代研究證明，杜仲葉的藥用有效成分與杜仲皮基本相同、藥用功能基本一致[9-10]，除此之外杜仲葉片也可加工成一種茶療珍品——杜仲茶。目前，對杜仲的研究主要集中在資源、栽培、化學成分及藥理活性和臨床應用等方面[11]，而對環(huán)境因子變化下杜仲生理生化特征及次生代謝過程研究還很薄弱。為此，筆者以我國傳統(tǒng)名貴中藥材杜仲為研究對象，在不同UV-B輻射增強條件下，通過對杜仲葉片光合作用、葉片活性成分含量及膜脂過氧化程度的研究，初步探討了UV-B輻射對杜仲葉片光合作用及次生代謝過程的影響，以期為葉用杜仲林的生態(tài)培育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料40W UV-B輻射燈管為北京電光源研究所產(chǎn)品；LI-6400型便攜式光合儀為美國LI-COR公司產(chǎn)品；高通量組織研磨器為浙江寧波新藝超聲設備有限公司產(chǎn)品。標準品桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平、京尼平苷和綠原酸均購于Sigma公司，純度≥98%。

1.2試驗設計

試驗于2016年9月18—21日在東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室實驗園內(nèi)進行，選取30株長勢一致的5年生杜仲（平茬后當年萌發(fā)的植株）分為3個處理，每個處理10株，在自然光照基礎上，根據(jù)試驗要求，增加0 （CK）、1.40 kJ/（m2·d）（T1）、2.81 kJ/（m2·d）（T2）3個不同輻射強度的UV-B輻射處理，UV-B（280～320 nm）輻射處理通過懸在植株上方的UV-B輻射燈管產(chǎn)生，每日處理時間為09∶00—17∶00。處理期間采用茶用杜仲林管理方法進行常規(guī)管理，保證水分、養(yǎng)分供應。處理3 d后選取植株頂端已完全展開的生長狀況及葉齡和葉位一致的葉片，測定各項生理指標，每個處理均隨機取樣，3次重復。

1.3試驗方法

1.3.1光合參數(shù)與光合色素的測定。

在實驗室處理周期內(nèi)，在晴天上午選取已完全展開的生長狀況良好、葉位一致的葉片，采用LI-6400型便攜式光合儀，測定凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）等光合參數(shù)，每個處理5次重復，取平均值。

光合色素含量參考Jiang等[12]的方法測定，稍作修改：稱取0.2 g杜仲葉片鮮樣，加入預冷的80%丙酮研磨成勻漿，5 000 r/min離心10 min，取上清液于紫外分光光度計665、649、480 nm波長處測定吸光值。

1.3.2次生代謝產(chǎn)物含量測定。

杜仲葉片桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸、京尼平苷及京尼平的提取參考Dong等[13]的方法：稱取0.5 g鮮樣，加入20 mL 60%甲醇（色譜純）于高通量組織研磨器（70 Hz）中保持 10 min，超聲提取25 min，8 000 r/min離心15 min，取上清殘渣用上述方法重提1次，合并上清液棄去殘渣，上清液在40 ℃下濃縮，用色譜純甲醇少量多次洗滌離心管，合并濃縮液，用甲醇定容至50 mL后過0.45 μm 微孔濾膜，將樣品保存在-20 ℃冰箱供色譜分析。

采用高效液相色譜儀（HPLC）同時測定5種主要活性物質（桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、京尼平、京尼平苷和綠原酸）。色譜儀Qtrap5500（AB公司），色譜柱C18（2.1 mm×100.0 mm，1.6 μm）；流動相：溶劑 A（62%水）與溶劑 B（38%甲醇），流速：0.25 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：5 μL。

黃酮、總酚、單寧樣品提取參考魏曉雪等[14]的方法：稱取0.5 g新鮮葉片，加10 mL酸性甲醇溶液（甲醇∶水∶鹽酸=79∶20∶1），室溫下研磨，于55 ℃水浴提取30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL，待測。黃酮含量測定采用尉芹等[15]的方法，于分光光度計510 nm波長處檢測吸光值；總酚的檢測采用Chaovanalikit等[16]的方法，于分光光度計765 nm波長處檢測吸光值；單寧含量測定采用王杰興等[17]的方法，于分光光度計442 nm波長處檢測吸光值。

1.3.3MDA、H2O2及O2·-含量測定方法。

MDA的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[18]；H2O2含量參考Patterson等[19]的測定方法，H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過氧化物-鈦復合物黃色沉淀，可被H2SO4 溶解后，在415 nm 波長處比色測定，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度呈線性關系；O2·-含量參考Jiang等[12]的方法測定。

1.4數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 19.0和Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析檢驗各處理組間差異顯著性和所有指標相關性，表中數(shù)值為平均值±標準誤。

2結果與分析

2.1光合參數(shù)與光合色素含量的變化

結果表明，增加環(huán)境UV-B輻射強度對杜仲葉片光合參數(shù)和光合色素含量均有顯著影響（表1和圖1）。與CK相比，提高UV-B輻射強度顯著降低杜仲葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），但T1與T2處理間差異不顯著。T2處理較CK處理的Pn、 Gs、Ci和Tr分別降低了13.62%、21.43%、11.31%和18.14%。低強度UV-B輻射顯著增加葉片光合色素含量，葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素在T1處理含量最高，分別達（0.740±0.030）、（0.410±0.019）和（1.150±0.049）mg/g，而各處理間類胡蘿卜素含量無顯著差異，增強UV-B輻射強度降低了葉綠素a/b比值，但差異并不顯著。

2.2次生代謝產(chǎn)物含量的變化

由表2可知，在增加UV-B輻射強度脅迫下，杜仲葉片重要次生代謝產(chǎn)物綠原酸含量隨UV-B輻射強度的增加而顯著降低；UV-B輻射增強顯著降低了桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷含量，T1處理的含量分別為（3.320 0±0.012 0）、（1.990±0.012）、（3.920±0.012） μg/g；低強度UV-B處理顯著增加了京尼平與黃酮含量，且T1較CK分別升高了21.2%和11.03%；總酚與單寧含量在T2處理時最高，分別達（1.290 0±0.023 0）和（17.30±1.44） μg/g。

安徽農(nóng)業(yè)科學2017年

2.3MDA、H2O2和O2·-含量的變化

由表3可知，與CK相比，T1與T2顯著增強MDA含量，T1與T2差異不顯著；H2O2含量在UV-B輻射增強下表現(xiàn)為：T2>T1>CK，與CK相比，T1與T2顯著提高杜仲葉片H2O2含量，但T2與T1處理間無顯著差異；O2·-含量在UV-B輻射增強下表現(xiàn)為：T1>T2>CK，且各處理間差異顯著；MDA與O2·-含量T1處理較CK升高了39.46%和70.48%，H2O2含量中T2處理較CK升高了43.51%。

2.4UV-B輻射下杜仲葉生理與代謝物質之間的相關性

相關分析結果表明，在UV-B輻射增強條件下，杜仲葉片生理指標間存在相關性（表4），京尼平、總酚、單寧含量與葉綠素b（Chlb）、MDA、O2·-含量存在顯著正相關關系；桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸，京尼平苷與葉綠素b（Chlb）、葉綠素（Chl）、MDA、H2O2、 O2·-含量存在顯著負相關關系，與葉綠素a/b（Chla/b）存在顯著正相關關系；綠原酸和類胡蘿卜素、MDA、H2O2存在顯著負相關關系；黃酮含量與葉綠素a（Chla）存在顯著正相關關系（r=0.71）。

3結論與討論

UV-B輻射對植物傷害機理一直是有關UV-B輻射研究的重點。該研究結果表明，UV-B輻射對葉用杜仲光合作用的影響主要表現(xiàn)為光合速率降低及光合色素含量的改變，高強度UV-B輻射造成光合速率下降的原因是由于氣孔阻力增大，增加氣孔對外界環(huán)境特別是大氣濕度的敏感性，同時CO2 的傳導率降低，引起胞間CO2濃度下降，從而影響CO2的同化效率[20]，最終導致杜仲葉片凈光合速率的下降。低強度UV-B處理下葉綠素含量增加，這有利于杜仲植株吸收和利用過多的光能以緩解UV-B輻射對植物造成的傷害[21]，但植物自身調(diào)節(jié)能力有限，隨著UV-B輻射強度的加大，導致杜仲葉片葉綠素含量在T2處理下降低，植物受到明顯傷害。植物體內(nèi)葉綠素多以葉綠素a/b-蛋白復合體的形式存在，雖然低水平UV-B輻射增強處理下葉綠素a與葉綠素b的含量升高了，但增加UV-B輻射強度降低了葉綠素a/b比值，表明UV-B 輻射對光合色素的光破壞是本質的[22]。糖和氨基酸等植物光合作用產(chǎn)物的組成及總量的積累對杜仲茶葉品質形成具有決定作用[23]，UV-B輻射降低杜仲葉片光合作用效率勢必影響其茶用的功能與品質，最直觀的影響即為杜仲茶的色澤。

次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應的結果，故不同植物在不同生長環(huán)境下體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不盡相同[24]。許多研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)UV-B輻射劑量能夠提高植物某些具有重要藥用價值和經(jīng)濟效益的次生代謝產(chǎn)物含量[25]，例如，研究發(fā)現(xiàn)提高環(huán)境UV-B輻射強度可顯著提高南方紅豆杉針葉紫杉醇含量[26]。該研究中的次生代謝產(chǎn)物桃葉珊瑚苷、京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸均屬于環(huán)烯醚萜類，當前環(huán)烯醚萜生物合成關鍵酶的研究主要集中在甲羥戊酸途徑（MVA）[27]和2-甲基赤蘚糖-4-磷酸途徑（MEP）[28]上系列關鍵酶及催化環(huán)烯醚萜骨架形成的萜類合酶等。該研究結果表明，UV-B輻射增強條件下杜仲葉片桃葉珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸含量較對照降低，僅京尼平含量升高，這與該研究之前的假定（UV-B輻射增強將促進主要活性物質含量提高）不同，隨后該研究在環(huán)境UV-B輻射控制條件下對3年生杜仲葉片中次生代謝產(chǎn)物含量進行測定，得出相同的結果。究其原因，導致桃葉珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸含量降低原因可能是UV-B輻射引起了MVA途徑和MEP途徑中某一關鍵酶的改變，有相關研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下玉米萜類合成途徑中的萜烯合酶基因2（TPS2）、萜烯合酶基因3（TPS3）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因4（GGPS4）在不同材料中表達量隨脅迫時間延長均先上調(diào)再下調(diào)[29]；京尼平含量升高可能是由于UV-B輻射增加了β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的能力[30]。有關環(huán)烯醚萜類代謝產(chǎn)物在非生物脅迫中的研究較少，故產(chǎn)生上述結果的原因有待進一步研究。

綠原酸與黃酮屬于苯丙素類物質，紫外輻射條件下，苯丙烷類化合物代謝和黃酮合成途徑中多種酶，包括 PAL、CHS、4CL、CHI、黃酮-3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮-4-還原酶（DFR）等的基因表達上調(diào)或者酶活性增強[31]。該研究表明，UV-B輻射升高增加了黃酮含量，降低了綠原酸含量，現(xiàn)有研究已證實增強UV-B輻射強度使得黃酮合成途徑上的相關基因被激活[32]，如PAL（丙氨酸裂解酶）、CAD（肉桂醇脫氫酶）、4CL（4-香豆酸輔酶A連接酶）、CHI（黃酮查爾酮異構酶）和DFR（二氫黃酮醇還原酶）等[33]，進而增加了黃酮含量。綠原酸含量下降可能是與由于UV-B輻射抑制了合成綠原酸通路上HQT的合成[34]。增加UV-B輻射強度總酚含量較對照升高，總酚物質可以保護感光目標免受氧化應激反應，故增加自身含量來降低UV-B輻射對植株的氧化傷害作用；酚類化合物的積累也可能與此類化合物可使植物免受因 UV 輻射帶來的 DNA 損傷或光抑制有關[35]。黃酮、總酚、單寧又均屬于紫外吸收物質，UV-B輻射增加激活了植物自身的防御系統(tǒng)，以提升紫外吸收物質來進行抵御或降低植株的受害情況[36]，杜仲葉片中上述活性物質組成及含量的改變將直接影響葉用杜仲林的經(jīng)濟價值。

植物葉綠體與線粒體是產(chǎn)生活性氧的主要細胞器[37]，前者進行光合作用時經(jīng)過一系列反應后電子傳遞能力增強時會產(chǎn)生大量的活性氧；后者進行呼吸作用時通過呼吸鏈為細胞提供能量，此過程中植物組織中耗費的氧約有1%產(chǎn)生了活性氧[38]，可見活性氧產(chǎn)生概率之廣。該研究表明，MDA、H2O2和O2·-在受到UV-B輻射增強條件下均有增加的現(xiàn)象，這與撒玉霞等[39]、沈嘉等[40]的研究結果一致。UV-B輻射刺激了貯存活性氧的細胞器如葉綠體、線粒體，使得細胞器內(nèi)發(fā)生電子傳遞過程中活性氧的積累，經(jīng)過一系列反應產(chǎn)生H2O2和O2·-，而活性氧的積累大大加劇了膜脂過氧化作用，使其產(chǎn)物MDA含量也隨之增加。細胞膜被認為是UV-B輻射的主要靶位點之一，UV-B照射可導致膜結構的損傷，膜脂氧化速度提高，導致活性氧自由基的產(chǎn)生[41]，最終導致膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累增加[42]。

總體來說，增加UV-B輻射強度對杜仲葉片光合作用、活性物質組成及含量的改變、活性氧自由基變化的影響將直接影響著杜仲葉的品質及其經(jīng)濟價值，如色澤、藥用保健功效等。環(huán)境因子變化對藥用植物品質及保健功能的影響是值得關注的，在當前全球變化的背景下，采用環(huán)境調(diào)控及生長因子調(diào)控等組合措施對杜仲植物資源進行定向培育，進一步提高其品質具有重要意義。

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安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：11-14