牛建麗+于永麗+曹艷杰+王猛

1 引 言

色氨酸（Tryptophan，Trp）作為一種生物體必需氨基酸，具有非常重要的生理功能，在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中起著非常重要的作用，也是機(jī)體煙酸、血清素及其它代謝產(chǎn)物的前體。臨床上，色氨酸不僅用于營(yíng)養(yǎng)輸液，也用于抑郁癥、高血壓及疼痛等病癥的治療[1]。適量攝入富含色氨酸的食物可以改善睡眠質(zhì)量、增強(qiáng)人體的抗氧化水平[2，3]。已報(bào)道的色氨酸的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[4，5]、電化學(xué)法[6，7]、毛細(xì)管電泳法[8]和熒光法[9～11]等。其中，高效液相色譜法和電化學(xué)法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但高效液相色譜分析中樣品前處理比較耗時(shí)、儀器操作相對(duì)復(fù)雜，電化學(xué)分析法對(duì)電極的制備要求較高。熒光分析法具有簡(jiǎn)單快速、方法重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，隨著各種新的熒光物質(zhì)不斷涌現(xiàn)，熒光分析法得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

稀土發(fā)光納米粒子是一類性能優(yōu)越的發(fā)光材料，具有發(fā)光強(qiáng)度大、發(fā)射譜線窄、發(fā)光壽命長(zhǎng)和Stokes位移大等特點(diǎn)，已被成功用于物質(zhì)的定量分析[12]、癌細(xì)胞成像[13]和靶向治療[14]等研究領(lǐng)域。近年來(lái)，基于研究體系的內(nèi)濾效應(yīng)進(jìn)行定量分析的研究有很多報(bào)道[15～18]，內(nèi)濾效應(yīng)（Inner filter effect，IFE）是指體系中熒光劑的激發(fā)或發(fā)射光被吸收劑（猝滅劑）吸收，從而導(dǎo)致熒光劑的熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象[19]。相比于熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，熒光內(nèi)濾效應(yīng)的發(fā)生不需要熒光體和吸收體發(fā)生化學(xué)結(jié)合，實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)單。與紫外分光光度法相比，利用熒光內(nèi)濾效應(yīng)將吸收體的吸收變化轉(zhuǎn)換為呈指數(shù)變化的熒光體的熒光強(qiáng)度變化，使得待測(cè)物的分析具有更高的靈敏度[20]。

本研究采用溶劑熱法合成發(fā)光性能和水溶性良好的YVO4∶Eu納米探針（YVO4∶Eu NPs），由于色氨酸的吸收光譜與YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光譜有很大程度的重疊，二者可以發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光能量，導(dǎo)致YVO4∶Eu NPs的熒光強(qiáng)度顯著降低，據(jù)此建立了測(cè)定色氨酸含量的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Cary Eclipse發(fā)光分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司）；PHS3E型pH酸度計(jì)（上海雷磁精密科學(xué)儀器有限公司）； UV2100雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞麗分析儀器有限公司）；TG16G臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）； TECNAI 20型透射電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）。

Y2O3、Eu2O3（北京有研稀土新材料股份有限公司）；原釩酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；聚乙烯亞胺（PEI10000，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）； L色氨酸（LTrp，阿拉丁試劑）；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 YVO4∶Eu NPs的制備 參照文獻(xiàn)[21]方法制備YVO4∶Eu納米粒子，實(shí)驗(yàn)中對(duì)合成條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下：分別移取濃度均為0.1 mol/L的Y（NO3）3溶液3.75 mL和Eu（NO3）3溶液1.25 mL于錐形瓶中，磁力攪拌下加入4 mL 0.4 g/mL PEI溶液，攪拌均勻，再加入5 mL 0.1 mol/L Na3VO4溶液，然后加入14 mL乙醇，最后調(diào)節(jié)至pH 9.0。在80 ℃水浴中反應(yīng)1 h，然后轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯罐中，將聚四氟乙烯罐放入反應(yīng)釜密封，置于160 ℃烘箱中反應(yīng)20 h。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻到室溫，得到Y(jié)VO4∶Eu 納米粒子的膠體溶液。向以上膠體溶液中加入乙醇，離心分離， 沉淀用乙醇和水洗滌沉淀，在超聲作用下，用10 mL水分散沉淀，即制得YVO4∶Eu NPs溶液。產(chǎn)物具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性，可以在室溫存放至少6個(gè)月，溶液外觀和發(fā)光性能沒(méi)有改變。以合成時(shí)加入的Y3+和Eu3+的總物質(zhì)的量計(jì)，溶液中YVO4∶Eu NPs的濃度為0.05 mol/L，分析應(yīng)用時(shí)，以水稀釋至相應(yīng)的濃度。若將YVO4∶Eu納米粒子溶液離心分離，沉淀經(jīng)干燥后可長(zhǎng)期保存，使用時(shí)超聲分散到水中即可。以羅丹明B為熒光標(biāo)準(zhǔn)物，測(cè)得所制備納米粒子的量子產(chǎn)率為17%。

3 結(jié)果與討論

3.1 YVO4∶Eu NPs的TEM表征

可用于生物分析的稀土發(fā)光納米粒子通常應(yīng)滿足以下要求：粒子的粒徑較小且分布均勻、發(fā)光強(qiáng)度大且穩(wěn)定、水溶性和生物相容性好。目前，常用的制備方法主要有水熱法[21]、溶劑熱法[22]、有機(jī)前驅(qū)體熱分解法[23]和惰性氣體保護(hù)下的高溫加熱合成[12]。

其中，熱分解法合成所用有機(jī)試劑有一定的毒性，惰性氣體保護(hù)高溫加熱合成的反應(yīng)條件相對(duì)比較苛刻。溶劑熱法反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單易行，與水熱法相比，所制備產(chǎn)物的結(jié)晶度和發(fā)光性能更好。因此，本研究采用溶劑熱法制備YVO4∶Eu 納米粒子。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)所制備納米粒子進(jìn)行了表征，結(jié)果見(jiàn)圖1，粒子形狀為類球形，粒度比較均勻， 粒徑在20 nm左右，分散性較好。

3.2 YVO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內(nèi)濾效應(yīng)

由于所制備的YVO4∶Eu 納米粒子表面修飾了PEI，可直接作為熒光探針使用，YVO4∶Eu NPs具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性。圖2為YVO4∶Eu NPs的激發(fā)光譜（a）和色氨酸的紫外吸收光譜（b），YVO4∶Eu NPs的最大激發(fā)峰位于280 nm，色氨酸的吸收光譜峰值位于278 nm，與YVO4∶Eu NPs的激發(fā)峰和色氨酸的吸收峰有很好的重疊，這表明YVO4∶Eu NPs和色氨酸體系具備發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)的條件。

向系列相同濃度的YVO4∶Eu NPs溶液中分別加入不同濃度色氨酸溶液，掃描YVO4∶Eu NPs的發(fā)射光譜。由圖3表明，隨著色氨酸濃度的增加，YVO4∶Eu NPs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。這是因?yàn)樯彼岷蚘VO4∶Eu NPs之間發(fā)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs激發(fā)光的能量，導(dǎo)致YVO4∶Eu NPs發(fā)射的熒光強(qiáng)度顯著降低。這為建立基于YVO4∶Eu NPs測(cè)定色氨酸的分析方法奠定了基礎(chǔ)。

3.3.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇 將YVO4∶Eu NPs和色氨酸溶液旋渦混合后，測(cè)定放置不同時(shí)間時(shí)體系的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果表明，10 min時(shí)體系的熒光強(qiáng)度降低幅度達(dá)到最大，且60 min內(nèi)基本不變。這說(shuō)明色氨酸和YVO4∶Eu NPs之間的熒光內(nèi)濾效應(yīng)可以很快發(fā)生，60 min內(nèi)反應(yīng)體系都很穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中YVO4∶Eu NPs的制備方法簡(jiǎn)單易行，所制備納米探針具有良好的水溶性和光學(xué)穩(wěn)定性。基于YVO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內(nèi)濾效應(yīng)，建立了測(cè)定色氨酸含量的方法。本方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏準(zhǔn)確的特點(diǎn)。采用本方法對(duì)醬油樣品中的色氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定，回收率良好。本實(shí)驗(yàn)拓展了稀土發(fā)光納米粒子的應(yīng)用范圍。

References

1 Sainio E L， Pulkki K， Young S N. Amino Acids， 1996， 10（1）： 21-47

2 Bravo R，Matito S， Cubero J， Paredes S D， Franco L， Rivero M， Rodriguez A B， Barriga C. AGE， 2013， 35（4）： 1277-1285

3 Silvan J M， van de Lagemaat J， Olano A， Del Castillo M D. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2006， 41（5）： 1543-1551

4 Cevikkalp S A， Loker G B， Yaman M， Amoutzopoulos B. Food Chem.， 2016， 193（15）： 26-29

5 Zhao J X. Biomed. Chromatogr.， 2015， 29（3）： 410-415

6 YA Yu， XIE LiPing， JIANG CuiWen， WANG TianShun， MO LeiXing， LI Tao， YAN FeiYan. Chinese J. Anal. Chem. ， 2016， 44（9）： 1394-1401

牙 禹， 謝麗萍， 蔣翠文， 王天順， 莫磊興， 李 燾， 閆飛燕. 分析化學(xué)， 2016， 44（9）： 1394-1401

7 Haldorai Y， Yeon S H， Huh Y S， Han Y K. Sens. Actuators B， 2017， 239 （2）： 1221-1230

8 Forteschi M， Sotgia S， Assaretti S， Arru D， Cambedda D， Sotgiu E， Zinellu A， Carru C. J. Sep. Sci. ， 2015， 38（10）： 1794-1799

9 Tayade K， Sonawane M， Torawane P， Singh A， Singh N， Kuwar A， Sen. Actuators B， 2017， 246 （7）： 563-569

10 Ghosh A， Talukdar S， Ghosh K， Das T， Das D. RSC Adv.， 2014， 4 （10）： 55286-55289

11 Sutariya P G， Pandya A， Lodha A， Menon S K. Analyst， 2014， 139（19）： 4794-4798

12 WANG Yu， REN ShuYue， JIANG HuiCong， BAI JiaLei， PENG Yuan， NING BaoAn， GAO ZhiXian. Chinese J. Anal. Chem. ， 2017， 45（1）： 35-41

王 瑜， 任舒悅， 姜會(huì)聰， 白家磊， 彭 媛， 寧保安， 高志賢. 分析化學(xué)， 2017， 45（1）： 35-41

13 Duée N， Ambard C， Pereira F， Portehault D， Vinan B， Vallé K， Autissier D， Sanchez C. Chem. Mater.， 2015， 27（15）： 5198-5205

14 Hu Y L， Wu B Y， Jin Q， Wang X Y， Li Y， Sun Y X， Hou J Z， Zhao X J. Talanta， 2016， 152 （5）： 504-512

15 Chen H Y， Fang A J， He L， Zhang Y Y， Yao S Z. Talanta， 2017， 164 （3）： 580-587

16 Liu H J， Li M， Jiang L Y，Shen F， Hu Y F， Ren X Q. Spectrochim. Acta， 2017， 173 （2）： 105-113

17 Liu Y Y， Li H C， Guo B， Wei L J， Chen B， Zhang Y Y. Biosens. Bioelectron.， 2017， 91（5）： 734-740

18 Chen C X， Zhao D，Hu T， Sun J， Yang X R. Sens.Actuators B.， 2017， 241（3）： 779-788

19 YANG ChuanXiao， YU MengWen， SONG DuoDuo， SUN XiangYing. Chemical Journal of Chinese Universities， 2016， 37（5）：852-859

楊傳孝， 余夢(mèng)雯， 宋朵朵， 孫向英. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 37（5）： 852-859

20 Zhu L J，Peng X， Li H T， Zhang Y Y， Yao S Z. Sens. Actuators B， 2017， 238（2）： 196-203

21 Chen Y C， Wu Y C， Wang D Y， Chen T M. J. Mater. Chem.， 2012， 22（16）： 7961-7969

22 Zhou J C， Yang Z L， Dong W， Tang R J， Sun L D， Yan C H. Biomaterials， 2011， 32（34）： 9059-9067

23 Liu Q， Sun Y， Yang T，F(xiàn)eng W， Li C， Li F. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17122-17125