李詠富+哈益明+郭琴+李慶鵬

摘 要 以γ射線引發(fā)順丁烯二酸β環(huán)糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，制備了順丁烯二酸β環(huán)糊精酯N乙烯基吡咯烷酮聚合物（CDMNVP）。優(yōu)化后的CDMNVP聚合物的合成條件為： CDM∶NVP為1∶0.7（w/w， CDM 3.6 g 和 NVP 2.52 g），輻照劑量4 kGy，DMF溶液用量為20 mL。在此條件下制備聚合物的產(chǎn)率為84%，重均分子量為20 kDa。結(jié)果表明，此聚合物可以同納他霉素（NM）和多菌靈（MBC）形成穩(wěn)定復(fù)合物。研究了復(fù)合物抑菌活性，測定了其表觀穩(wěn)定常數(shù)。利用紫外光譜、核磁圖譜和相溶解度對藥物復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。303 K下，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)分別為12988.54和865.94 L/mol。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP復(fù)合物可以顯著提高NM和MBC的溶解性和抑菌活性。

關(guān)鍵詞 β環(huán)糊精； N乙烯基吡咯烷酮； γ射線輻照聚合； 抑菌活性

1 引 言

N乙烯基吡咯烷酮（NVP）常用于合成聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）線性聚合物。PVP是非離子型、水溶性高的高分子精細(xì)化學(xué)品，具有優(yōu)異的性能和廣泛的用途，PVP是目前國際上公認(rèn)的合成藥中最重要的3種藥用輔料之一[1]。對于疏水性藥物用PVP作黏合劑，不但易于均勻濕潤，而且可使疏水性藥物顆粒表面變?yōu)橛H水性，有利于藥物的溶出和片劑的崩解，可加快溶出速率[2，3]。交聯(lián)的PVP（水不溶）還多用于蛋白的提取及檢測中。張偉等[4]利用交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）處理紅葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，利用質(zhì)譜法檢測了紅酒中的蛋白過敏源。

環(huán)糊精的特殊結(jié)構(gòu)使其可與多種分子形成穩(wěn)定的主客體包合物，已廣泛用于分子識別、分子組裝、藥物載體、模擬酶以及結(jié)構(gòu)異構(gòu)和立體異構(gòu)化合物的分離[5]。常用的β環(huán)糊精的溶解度低，25℃時在水中的溶解度僅為1.85 g/100 mL [6]。研究者采用了多種方法提高β環(huán)糊精在水中的溶解度，其中制備β環(huán)糊精高分子聚合物是較為常用的方法之一。制備β環(huán)糊精高分子聚合物常用的方法包括化學(xué)交聯(lián)法[7～9]和自由基鏈?zhǔn)骄酆戏╗10]。自由基鏈?zhǔn)骄酆戏òɑ瘜W(xué)引發(fā)和輻射聚合法，與化學(xué)交聯(lián)法相比，無需添加有毒化學(xué)交聯(lián)劑，純化工藝簡單，其中輻射聚合法具有無化學(xué)引發(fā)劑添加、易于調(diào)節(jié)、電離輻射與物質(zhì)作用無選擇性等優(yōu)點(diǎn)[11，12]。

本研究以順丁烯二酸β環(huán)糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）為聚合單體，利用γ射線引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成新型水溶性β環(huán)糊精高分子聚合物?？疾炝耸杷砸志幬锒嗑`（MBC）和納他霉素（NM）在CDMNVP聚合物中的溶解性質(zhì)及其藥物復(fù)合物的抑菌效果和藥物緩釋特性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV1800紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）； Tensor 37紅外光譜儀（德國Bruker Optics公司）； Pyris115熱重分析儀（美國Perkin Elmer公司）； AVANCE III核磁共振儀（瑞士Bruker公司）； Quanta 200FEG掃描電子顯微鏡（美國 FEI公司）； MCR301流變儀（奧地利Anton Paar公司）； Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）

β環(huán)糊精購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，使用前，將250 g β環(huán)糊精溶于1 L熱水（80℃）中，冷卻至室溫后， 在4℃下重結(jié)晶； 棄去上層液體，晶體于90℃干燥； 重復(fù)溶解、結(jié)晶、干燥2次； 置于干燥器內(nèi)，備用。

順丁烯二酸購于阿拉丁試劑（上海）有限公司； N乙烯基吡咯烷酮（NVP）、一水次亞磷酸鈉（SHP）、4甲氧基酚和乙醇、NaNO3、NaN3、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·4H2O、蔗糖、瓊脂和乙醇均購于國藥集團(tuán)公司化學(xué)試劑有限公司。多菌靈（MBC）和納他霉素（NM）購于上海士鋒生物科技有限公司。葡聚糖（Dextran）標(biāo)準(zhǔn)品購于SigmaAldrich 公司，相對分子質(zhì)量40 kDa。試劑除特別說明外，均為分析純。黑曲霉菌株04523購于中國科學(xué)院微生物研究所。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 順丁烯二酸β環(huán)糊精酯的制備

順丁烯二酸β環(huán)糊精酯（CDM）采用半干反應(yīng)法[13]制備。將6.81 g（6 mmol）βCD同順丁烯二酸（24 mmol）和次亞磷酸鈉（SHP，0.5 倍（mol/mol）順丁烯二酸用量）加入耐壓瓶內(nèi)，加入阻聚劑4甲氧基酚（2.5%（w/w）順丁烯二酸用量），混勻后，按固液比1∶0.6 （w/w）加入相應(yīng)量的水，混勻，110℃反應(yīng)3.5 h。

2.3 CDMNVP聚合物的合成

稱量適量NVP和CDM 于50 mL具塞三角瓶內(nèi)，混勻。加入DMF溶液（50%，V/V，氮?dú)饷撗酰┯谏鲜鋈瞧績?nèi)，磁力攪拌至固體溶解，封口膜密封； 60Coγ輻射源進(jìn)行輻射共聚處理，劑量范圍2～10 kGy，劑量率為0.5 kGy/h。反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，5 mL水洗滌三角瓶3次； 反應(yīng)物冷凍干燥。干燥后的反應(yīng)物加入80 mL無水乙醇浸泡24 h，抽濾，濾餅用50 mL無水乙醇在杯式榨汁機(jī)中洗滌3次，抽濾，收集濾餅，60°C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥6 h，稱重。單因素實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)物產(chǎn)率和CDMNVP的重均分子量作為評價依據(jù)。

2.4 CDMNVP聚合物的結(jié)構(gòu)表征

對1 mg/mL CDMNVP聚合物、2 μg/mL丙烯酰胺、5 μg/mL順丁烯二酸β環(huán)糊精酯（CDM）溶液進(jìn)行紫外光譜測定。少量實(shí)驗(yàn)樣品與干燥KBr（約300 mg）置于研缽內(nèi)混勻、研磨、壓片，測定其紅外光譜。

CDMNVP聚合物樣品溶于重水（D2O）中，測定其磁共振圖譜，測定溫度25℃。

CDMNVP聚合物水溶液的流變學(xué)特性采用流變儀測定，溫度（25.00 ± 0.01）℃。觀察不同濃度下，CDMNVP聚合物和均聚物水溶液的剪切速率與剪切應(yīng)力之間的關(guān)系及溶液表觀粘度變化； 考察乙醇濃度對CDMNVP聚合物及均聚物流變學(xué)特性的影響和溶液表觀粘度的變化。

2.5 相溶解度實(shí)驗(yàn)

MBC用1 mol/L HCl溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定281 nm處吸光度值，得到測定多菌靈濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程； NM用甲醇溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定303 nm處吸光度值，得到NM的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用于MBC和NM的濃度測定。

分別將納他霉素（NM， 50 mg）和多菌靈（MBC， 10 mg）加入含有10 mL 不同濃度CDMNVP聚合物（重均分子量為20 kDa）水溶液（0.5， 1.0， 1.5， 2.0 和 2.5 mmol/L）的具塞三角瓶內(nèi)，封口膜密封，在303、313和323 K水浴中振蕩3 d； 將懸濁液用0.45 μm微孔濾膜過濾，測定濾液中NM和MBC的濃度。不同溫度下藥物復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)（Kc）按式（2）計(jì)算[12]：

2.6 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用察氏瓊脂法[13]考察不同濃度下藥物復(fù)合物對黑曲霉04523的抑制活性。分別吸取相溶解度實(shí)驗(yàn)中303 K下的藥物濾液（15 μL），分兩次加到濾紙片（Ф=

6 mm）上，將濾紙片均勻分布于瓊脂培養(yǎng)基上，35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 和48 h后，測量抑菌圈大小。

2.7 CDMNVP聚合物中單體殘留量測定

配制含NPV分別為0.05、0.25、0.50、1.00、5.00和10.00 μg/mL的系列溶液，色譜法測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件如下： 色譜柱為InnovalC18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動相為乙腈水（15∶85， V/V）； 流速 1.0 mL/min； 紫外檢測波長200 nm； 進(jìn)樣量 10 μL； 柱溫 25℃。

CDMNVP聚合物用10%（V/V）乙腈水溶解，溶液濃度為1 mg/mL，色譜條件同上。NVP殘留量以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 影響CDMNVP制備的因素

PVP結(jié)構(gòu)中存在大量的內(nèi)酰胺鍵，在280 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收（圖1C），而碳水化合物在此波長下紫外吸收很弱（圖1A）。在CDMNVP聚合物中同時含有β環(huán)糊精基團(tuán)和NVP結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺鍵，因此在CDMNVP聚合物凝膠色譜圖（圖1B）中具有弱紫外吸收的峰1為CDMNVP聚合物，具有強(qiáng)紫外吸收的峰2為PVP均聚物； 在溶劑峰（22 min）后為未反應(yīng)的NVP單體及其它鹽類分子的示差吸收峰。輻照法合成CDMNVP聚合物的副反應(yīng)為NVP單體分子間的自聚反應(yīng)。

隨著NVP反應(yīng)物量的增加，聚合物和均聚物的分子量隨之增大，有利于聚合物分子鏈的延長。但NVP的量加大，會造成產(chǎn)率的降低，因?yàn)樵黾訂误w濃度的同時也增加了均聚反應(yīng)。輻照劑量的增加會造成產(chǎn)物產(chǎn)率的下降，增大輻照劑量也會增加副反應(yīng)的發(fā)生； 此外，CDM單體有可能因過高的輻照劑量而發(fā)生降解。隨著DMF溶液用量增加，聚合物和均聚物的分子量隨之增高，產(chǎn)物的產(chǎn)率隨之降低，因?yàn)槿芤后w積增加，降低了CDM與自由基作用的幾率，有利于NVP單體參與均聚反應(yīng)。

優(yōu)化后的CDMNVP聚合物的合成條件： CDM與NVP質(zhì)量比為1∶0.7（3.6 g CDM 和 2.52 g NVP），輻照劑量4 kGy，50%（V/V）DMF溶液20 mL。聚合物的產(chǎn)率為84%，聚合物分子量為20 kDa。

切速率之間呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系（圖4E），PVP均聚物水溶液是典型的牛頓型流體。CDMNVP聚合物與PVP均聚物之間的流變學(xué)差異也證明合成得到了CDMNVP聚合物。CDMNVP聚合物流體類型與PVP均聚物的流體類型不同，可能是NVP結(jié)構(gòu)中五元環(huán)結(jié)構(gòu)與CDMNVP聚合物中β環(huán)糊精的環(huán)狀之間的作用力所致。CDMNVP聚合物水溶液的表觀粘度與濃度之間呈線性關(guān)系（圖4C）。在乙醇溶液中，CDMNVP聚合物呈現(xiàn)出牛頓型流體的特性（圖4B），其剪切應(yīng)力與剪切速率之間存在明顯的線性關(guān)系，這可能與CDMNVP聚合物中PVP鏈段容易溶于乙醇有關(guān)，加入乙醇后，降低了NVP中五元環(huán)結(jié)構(gòu)同β環(huán)糊精的環(huán)之間的作用力。隨著乙醇濃度的增加，CDMNVP聚合物表觀粘度先增大后減?。▓D4D），而PVP均聚物的表觀粘度隨乙醇濃度的增加呈線性增長。乙醇對CDMNVP聚合物的水化層造成了破壞，增大了CDMNVP聚合物分子間的作用力，從而使得開始階段聚合物水溶液的表觀粘度隨乙醇濃度的增大而增大； 而隨著乙醇濃度進(jìn)一步增大，CDMNVP聚合物中PVP鏈段開始溶于高濃度乙醇，使得分子間的阻力變小，CDMNVP乙醇溶液的粘度開始下降。

3.3 相溶解度

藥物在CDMNVP聚合物水溶液中的溶解度與聚合物的摩爾濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖5）。303 K下，隨著聚合物濃度增加， NM和MBC的溶解度分別增加了17.4倍和2.78倍。與MBC相比， CDMNVP聚合物僅對NM有很好的增溶作用。NM和MBC在CDMNVP聚合物水溶液中的表觀穩(wěn)定系數(shù)見表2。

303 K下， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)明顯高于NM在βCD中的表觀穩(wěn)定系數(shù)（1010 L/mol）和MBC在HPβCD中的表觀穩(wěn)定系數(shù)（61.07 L/mol）。NM·CDMAM復(fù)合物在水溶液中的穩(wěn)定性更高，因?yàn)镹M分子結(jié)構(gòu)更大，更加適合聚合物中βCD環(huán)的大小。隨著溫度的升高， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP復(fù)合物的表觀穩(wěn)定系數(shù)Kc逐漸下降，說明藥物與聚合物形成包埋復(fù)合物的過程有可能是放熱過程，升高溫度不利于復(fù)合物的穩(wěn)定。CDMNVP對NM的溶解性優(yōu)于順丁烯二酸β環(huán)糊精酯丙烯酰胺聚合物（CDMAM）[14]。NM和CDMNVP中PVP鏈段在親水性上具有相似性，NM和CDMNVP在乙醇水中的溶解性較好，根據(jù)相似相溶原理，NM更易溶解于CDMNVP的水溶液。

3.4 CDMNVP藥物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

對比MBC、NM與其同CDMNVP的藥物復(fù)合物的紫外圖譜，MBC最大紫外吸收波長在274.6 nm處，NM的最大紫外吸收波長在303.5 nm處[14]，而藥物復(fù)合物的最大吸收波長分別紅移至275.3 nm和305 nm（圖6A）說明MBC 和NM與CDMNVP聚合物形成了包埋復(fù)合物。

如圖6B所示， MBC中苯環(huán)上H的化學(xué)位移在7.13 ppm（2H和3H）和7.40 ppm（1H 和4H）。NM結(jié)構(gòu)中不飽和酯鍵中上乙烯基氫（1H 和2H）的化學(xué)位移為6.41 ppm，共軛多烯結(jié)構(gòu)上氫（15H ～ 22H）的化學(xué)位移為6.08 ppm [14]。當(dāng)MBC與CDMNVP聚合物形成復(fù)合物后，MBC中苯環(huán)上H的化學(xué)位移向低場移動，苯環(huán)上H的化學(xué)位移在7.44 ppm（2H和3H）和7.64 ppm（1H and 4H）處。而在NM·CDMNVP復(fù)合物中，NM結(jié)構(gòu)中不飽和酯鍵中上乙烯基氫（1H和2H）的化學(xué)位移移向低場6.76和6.73 ppm處。上述結(jié)果表明，MBC和NM分別同CDMNVP形成了包埋復(fù)合物。

3.5 CDMNVP藥物復(fù)合物的抑菌效果

NM和MBC與CDMNVP聚合物形成復(fù)合物后，提高了NM和MBC的抑菌活性，并延長了其抑菌時間。隨著CDMNVP聚合物濃度的增大，其對藥物NM和MBC的吸附量也增大，因而其藥物復(fù)合物的抑菌活性增強(qiáng)（圖7），抑菌時間延長。由于NM在CDMNVP水溶液中具有更好的溶解性，NM·CDMNVP復(fù)合物的抑菌效果明顯好于MBC·CDMNVP復(fù)合物的抑菌效果。

3.6 CDMNVP中N乙烯基吡咯烷酮?dú)埩袅?/p>

輻照劑量為2、4、6、8和10 kGy時，CDMNVP聚合物中NVP殘留量分為0.13、0.072、0.047、0.023和0.012 μg/mg。隨著輻照劑量的增大，NVP的殘留量逐漸降低。比較CDMNVP及順丁烯二酸β環(huán)糊精酯丙烯酰胺（CDMAM）聚合物中單體殘留量[14]，CDMNVP聚合物中單體殘留遠(yuǎn)低于CDMAM聚合物中單體的殘留量，說明NVP單體更容易發(fā)生輻照聚合。

4 結(jié) 論

NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP的表觀穩(wěn)定系數(shù)低于NM·CDMAM和MBC·CDMAM復(fù)合物的穩(wěn)定系數(shù)[14]，尤其是MBC·CDMAM穩(wěn)定系數(shù)下降更為明顯，主要是由于CDMNVP聚合物分子量下降所致，CDMNVP的重均分子量為20 kDa。但NM在CDMNVP溶液中的濃度高于其在CDMAM聚合物溶液中的濃度，說明單體種類對藥物溶解性也有很大影響。CDMNVP聚合物中PVP鏈段與NM在溶解性上具有相似性，NM更容易同聚合物分子上βCD結(jié)構(gòu)單元發(fā)生包埋復(fù)合作用。對于不種單體制備的βCD高分子聚合物，聚合單體的性能和結(jié)構(gòu)對于藥物復(fù)合物的穩(wěn)定作用有很大的異。這種影響主要取決于βCD高分子聚合物中兩個CDM單元之間均聚物鏈段（PVP和PAM）同藥物分子之間溶解性差異和βCD高分子聚合物分子量的大小。

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Abstract βCyclodextrinNvinyl2pyrrolidone （CDMNVP） copolymer was prepared by free radical chain reaction of Nvinyl2pyrrolidone （NVP） and βCD maleate （CDM） with γray as initiator. The synthesis conditions of CDMNVP polymer were as follows： mass ratio of CDM to NVP was 1∶0.7 （CDM 3.6 g and NVP 2.52 g）， irradiation dosage was 4 kGy， and DMF aqueous solution （50%， V/V） was set at 20 mL. Under the synthesis conditions， the yield of CDMNVP was 84% and the weightaverage molecular weight was 20 kD. The natamycin （NM） and carbendazim （MBC） could form stable inclusion complexes with CDMNVP copolymer， and the solubility and fungicidal activity of the complexes were investigated. The stability constant of NM·CDMNVP and MBC·CDMNVP complexes at 303 K were 12， 988.54 L/mol and 865.94 L/mol， respectively. The complexes were characterized using phase solubility diagrams， nuclear magnetic resonance （NMR） spectra and ultraviolet （UV） spectra. The analysis of the biological activities of these two complexes indicated that they possessed enhancing fungicidal activities compared to NM and MBC alone.

Keywords βCyclodextrin； NVinyl2pyrrolidone； γRay initiated polymerization； Bacteriostatic activity