孟建宇，張曦媛，王巧玲

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

外源纖維素誘導(dǎo)下纖維素降解細(xì)菌的分離

孟建宇*，張曦媛，王巧玲

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

對(duì)生物結(jié)皮和沙土的混合物分別加入秸稈和木屑進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基對(duì)樣品中的纖維素降解菌進(jìn)行分離和記數(shù)分析。結(jié)果共篩得4株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的細(xì)菌，16S rDNA序列分析表明，它們分別屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。從計(jì)數(shù)結(jié)果可以看出，外源纖維素誘導(dǎo)物，特別是秸稈的添加，會(huì)明顯提高生物結(jié)皮和沙土混合物中的纖維素降解菌的生長(zhǎng)繁殖能力。

纖維素降解細(xì)菌；外源纖維素；誘導(dǎo)；分離；計(jì)數(shù)

植物材料的主要成分為纖維素，是自然界最豐富的可再生資源之一（吳琳等，2009；呂靜琳等，2009）。地球上纖維素生物質(zhì)資源尤為豐富，年產(chǎn)逾2×106萬(wàn)噸，但部分資源因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)難以被分解利用，大多以堆積、焚燒等形式直接進(jìn)入環(huán)境，造成對(duì)資源極大的浪費(fèi)（廖青等，2014；牛秋紅等，2012；鄧先余等，2012；趙銀瓶等，2012）。因此研究如何利用高效纖維素降解菌降解纖維素對(duì)于解決世界能源危機(jī)及環(huán)境問(wèn)題具有積極的意義（鄭銳東等，2015；王雙等，2012；劉永生等，2003）。目前國(guó)內(nèi)對(duì)產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌分離篩選主要圍繞厭氧或兼性厭氧的菌種進(jìn)行，采用纖維素分解菌分離培養(yǎng)基進(jìn)行初篩后，利用CMC-Na剛果紅平板進(jìn)行高效菌株的進(jìn)一步分篩（鄧先余等，2012；樊程等，2012；劉占英等，2008）。

生物結(jié)皮的形成是荒漠化生態(tài)恢復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵一步（Bassin等，2011）。而纖維素降解菌不僅是土壤微生物中的主要類(lèi)群，又是生物結(jié)皮形成的最主要的一類(lèi)先驅(qū)微生物（邵玉琴等，2004），其可將纖維素降解成單糖加以利用，是土壤中碳源的主要來(lái)源（Lynd等，2002）。本文通過(guò)從加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的生物結(jié)皮和沙土的混合物中富集篩選纖維素降解菌株，分析外源誘導(dǎo)物對(duì)混合物中纖維素降解細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步研究纖維素酶活性、產(chǎn)酶條件優(yōu)化等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 分離樣品分離樣品是加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的生物結(jié)皮和沙土的混合物。未加任何物質(zhì)的沙土和結(jié)皮混合物為空白對(duì)照。

1.2 培養(yǎng)基纖維素分解菌分離培養(yǎng)基：CMCNa 5 g，營(yíng)養(yǎng)鹽100 mL，瓊脂2 g。

營(yíng)養(yǎng)鹽：K2HPO42 g，（NH4）H2PO40.5 g，Mg-SO42 g，MnSO4·H2O 2.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg，NaCl 0.3 g，H2O 1000 mL。

剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，CMC-Na 2 g，剛果紅0.2 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，H2O 1000 mL，瓊脂12 g。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，H2O 1000 mL，pH 7.4～7.6。

羧甲基纖維素固體選擇性培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，酵母粉2 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL。

1.3 纖維素分解菌的篩選與計(jì)數(shù)菌種初篩：分別稱(chēng)取10 g誘導(dǎo)10 d的樣品和對(duì)照樣品溶于90 mL無(wú)菌水中，再按10倍稀釋法稀釋成不同的濃度，取10-3、10-4、10-5三種稀釋度，涂布于纖維素選擇性培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行，28℃恒溫培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌群后，挑菌落劃線(xiàn)分離直至長(zhǎng)出單菌落。

菌種復(fù)篩：將分離純化的單菌落接種于剛果紅培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3~5 d，挑選出在平板上生長(zhǎng)快，產(chǎn)生大的透明水解圈的單菌落。

計(jì)數(shù)：分別對(duì)培養(yǎng)0、10和30 d的空白樣、加秸稈誘導(dǎo)樣、加木屑誘導(dǎo)樣的細(xì)菌和纖維素分解菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 菌種的鑒定選取水解圈較大的菌株進(jìn)行分子鑒定。在8000 r/min條件下離心3 min，收集1~3 mL菌液，加入1 mL TE緩沖液洗滌后再次離心，重懸，進(jìn)行DNA的提?。ê鷷约t等，2008）。利用細(xì)菌16S rDNA基因通用擴(kuò)增引物27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′）和1492R（5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′）對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用熒光染料SYBR GREENⅠ（廈門(mén)百維信）為標(biāo)記進(jìn)行電泳檢測(cè)。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京中科瑞泰生物科技公司）進(jìn)行純化。然后利用pMD19-T載體與目的片段連接，進(jìn)行重組載體的轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含Amp的LB篩選平板上，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取陽(yáng)性克隆子，采用質(zhì)粒插入檢測(cè)引物M13+（5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′）和M13-

（5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′）進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒檢測(cè)，挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序由北京六合華大基因公司完成。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastn程序?qū)Λ@得的16S rDNA序列進(jìn)行分析，確定待測(cè)菌株的種屬關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離用纖維素選擇培養(yǎng)基初篩出生長(zhǎng)較快的10株菌，然后將其接種于剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，水解圈較大的有4株菌，分別為RD01、RD04、RD06、RD10，4株菌的形態(tài)見(jiàn)圖1，圖2是菌株RD01的在剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈。

圖1 菌株RD01、RD04、RD06、RD10的菌落形態(tài)

圖2 RD01菌株在剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈

2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)由表1可知，無(wú)論是加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的樣品還是空白樣品隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加細(xì)菌總數(shù)都在不斷增加，但是加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的樣品增加幅度沒(méi)有空白大；隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，無(wú)論是加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的樣品還是空白樣品纖維素降解菌的數(shù)目也在不斷增加，但是，加入秸稈和木屑誘導(dǎo)的樣品明顯比空白增加幅度大，而且秸稈誘導(dǎo)效果要明顯好于木屑誘導(dǎo)的效果。

表1 細(xì)菌總數(shù)及纖維素降解菌數(shù)

2.3 菌種的鑒定提取4株細(xì)菌的總DNA后進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后進(jìn)行目的片段的連接轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果4株菌菌落分別擴(kuò)增出單一、清晰且明亮的條帶（圖3）。用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blastn程序?qū)Λ@得的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，4株纖維素降解細(xì)菌分別來(lái)源于4個(gè)不同的屬，即RD01為鏈霉菌屬（Streptomyces），RD04為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），RD06為假單胞菌屬（Pseudomonas），RD10為芽孢桿菌屬（Bacillus），其同源性都在99%以上（表2）。

圖3 陽(yáng)性克隆子菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)

表2 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

3 結(jié)論與討論

纖維素降解菌在秸稈、木屑等纖維素類(lèi)碳源物質(zhì)誘導(dǎo)下，可產(chǎn)生纖維素酶（高春等，2008），并且可明顯提高纖維素降解菌和其他細(xì)菌的數(shù)量，也有利于纖維素降解菌的分離（孟杰等，2011）。本研究通過(guò)選擇性培養(yǎng)基對(duì)樣品中的纖維素降解菌進(jìn)行初篩、復(fù)篩及計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，加入外源誘導(dǎo)物的纖維素降解菌對(duì)其他細(xì)菌產(chǎn)生了拮抗作用。這不僅為研究提供了分離富集纖維素降解菌的方法，也說(shuō)明了此方法具有可行性。外源纖維素誘導(dǎo)下纖維素降解菌的豐度會(huì)有一定程度的增加，由于秸稈纖維比木質(zhì)素含量更高的木屑更容易降解（趙吉睿等，2013），使得秸稈纖維素的誘導(dǎo)能力要強(qiáng)于木屑纖維素。

基于細(xì)菌的16S rDNA在進(jìn)化上具有高度的保守性，所以可通過(guò)16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源性比較和分屬鑒定。本試驗(yàn)復(fù)篩出的4株纖維素降解細(xì)菌分別屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。這些菌屬都是常見(jiàn)的有纖維素降解能力的種屬，大部分還是低溫纖維素降解菌來(lái)源種屬（羅立津等，2015）。

篩選優(yōu)良的纖維素降解菌對(duì)提高生物降解的效果有著很大的意義。目前所篩選到的菌種雖然具有一定的產(chǎn)纖維素酶能力，但是因纖維素酶系的多型性，纖維素的酶解是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。菌種的產(chǎn)酶及酶活受諸多因素影響，因此應(yīng)綜合考慮后確定產(chǎn)酶條件（高小朋等，2011）。

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Two cellulose materials（wheat straw and sawdust）were added separately into the mixture of biological crust and sand to isolate and count cellulose-degrading bacteria by selective media.As a result，4 bacterial strains with high cellulose-degrading ability were isolated.The 16S rDNA sequence analysis indicated that they belong to Acinetobacter，Bacillus，Streptomyces and Pseudomonas，respectively.The results of bacterial counting showed that the exogenous cellulose especially wheat straw，can rapidly increased the growth of cellulose-degrading bacteria in the mixture of biological crustand sand.

cellulose-degrading bacteria；exogenous cellulose；induction；isolation；counting

S816.3

A

1004-3314（2017）11-0033-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171107

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460002）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（NJZY14084）

*通訊作者