劉輝，季海峰，王四新，張董燕，張偉，王晶，單達(dá)聰，王雅民

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097）

短乳桿菌ZLB004發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

劉輝，季海峰*，王四新，張董燕，張偉，王晶，單達(dá)聰，王雅民

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097）

為得到短乳桿菌ZLB004最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，本試驗(yàn)研究了不同碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素對短乳桿菌活菌數(shù)的影響，并利用響應(yīng)面分析法對篩選出的主培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，得到短乳桿菌ZLB004的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖31.4 g/L、酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、乙酸鈉7.5 g/L、檸檬酸氫二銨3 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鋅0.6 g/L、吐溫-80 1 ml/L、pH 6.5。短乳桿菌ZLB004在此培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)可達(dá)3.15×109cfu/mL，是優(yōu)化前活菌數(shù)的4.03倍。

短乳桿菌ZLB004；發(fā)酵培養(yǎng)基；響應(yīng)面；優(yōu)化

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，因其具有營養(yǎng)、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能（李瑞等，2013；Xie等，2011），在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛的研究和應(yīng)用。乳酸菌對營養(yǎng)的要求特殊而復(fù)雜，正常生長不僅需要碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且營養(yǎng)物質(zhì)的組成及配比對菌體生長影響重大（劉輝等，2016；Dumbrepatil等，2008），因此需要對營養(yǎng)物質(zhì)組成和配比進(jìn)行優(yōu)化，篩選出適合乳酸菌生長的培養(yǎng)基。

短乳桿菌ZLB004（Lactobacillus brevis ZLB004）是分離自健康斷奶仔豬腸黏膜中的一株優(yōu)良乳酸菌，具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽性，動物試驗(yàn)表明，該菌在改善腸道菌群、增加營養(yǎng)物質(zhì)利用率、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高生長性能等方面具有良好的效果（Liu等，2015；劉輝等，2013）。為了提高短乳桿菌ZLB004發(fā)酵液中的活菌數(shù)，本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株L.brevis ZLB004分離自健康斷奶仔豬腸黏膜，已通過中國普通微生物菌種保藏管理中心鑒定，由本研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.19 g/L，Tween-80 1 mL/L，pH值6.5。121℃滅菌15 min。

1.3 活化與接種發(fā)酵L.brevis ZLB004菌株保存于-80℃冰箱，使用前按1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化兩代?；罨蟮木N以1%接種量接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后測定菌體生長情況。

1.4 活菌計(jì)數(shù)采用菌落平板計(jì)數(shù)法計(jì)算發(fā)酵液中的活菌含量：將發(fā)酵液用滅菌生理鹽水進(jìn)行十倍梯度稀釋，選擇合適的3個梯度進(jìn)行平板涂布，每個梯度設(shè)3個平行，37℃培養(yǎng)48 h計(jì)菌落總數(shù)。

1.5 單因素試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他成分，采用不同的碳源和氮源分別取代MRS中的碳源和氮源配制培養(yǎng)基，接種發(fā)酵，根據(jù)菌體生長情況對其最優(yōu)碳源和氮源進(jìn)行判斷和篩選；在碳氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別添加不同的緩沖鹽體系和微量元素，接種發(fā)酵，根據(jù)菌體生長情況，確定緩沖鹽體系和微量元素的種類。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化主培養(yǎng)基

1.6.1 Plackett-Burman（P-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著影響因子采用P-B兩水平法，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對篩選出的碳源、氮源、緩沖鹽、微量元素等9種因素進(jìn)行考察，每個因素各取2個水平，以短乳桿菌發(fā)酵液的活菌數(shù)為響應(yīng)值，篩選出對短乳桿菌活菌數(shù)影響顯著的因素（Soliman等，2005）。

1.6.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定重要影響因素的水平對P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選得到的顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度，進(jìn)而確定試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

1.6.3 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素及水平，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，采用minitab 16軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到一個響應(yīng)變量與自變量之間的模型。根據(jù)建立的模型計(jì)算得到L.brevis ZLB004的最佳增殖培養(yǎng)基配方。

1.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn)將活化好的種子液按1%的比例分別接種至普通MRS培養(yǎng)基和1.6.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的增殖培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h計(jì)菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基營養(yǎng)成分

2.1.1 不同碳源對活菌數(shù)的影響碳源物質(zhì)是構(gòu)成培養(yǎng)基的主要成分之一，能夠提供細(xì)胞物質(zhì)中的碳素來源和微生物生長發(fā)育過程中所需要的能量。不同碳源對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響見圖1。由圖1可知，以葡萄糖為培養(yǎng)基唯一碳源時(shí)，短乳桿菌的活菌數(shù)最高，為7.6×108cfu/mL，遠(yuǎn)高于其他11種碳源，因此選擇葡萄糖作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同碳源對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響

2.1.2 不同氮源對活菌數(shù)的影響選擇10種常用的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響見圖2。由圖2可知，與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源更適合短乳桿菌的生長，并且當(dāng)?shù)礊榕Ｈ獾鞍纂?、牛肉膏和酵母粉時(shí)，短乳桿菌的活菌數(shù)優(yōu)于其他幾種。乳酸菌對氮源的需求比較高，而復(fù)合氮源比單一氮源更有利于乳酸菌的生長（Vinodh等，2011），綜合考慮，選擇牛肉蛋白胨、牛肉膏和酵母粉作為后續(xù)研究的氮源。

圖2 不同氮源對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響

2.1.3 不同緩沖鹽對活菌數(shù)的影響在前面碳氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，添加5種不同的緩沖鹽體系，根據(jù)短乳桿菌菌體生長情況，確定最優(yōu)的緩沖鹽體系。由圖3可知，不同的緩沖鹽對菌體的增殖效果各不相同，其中以檸檬酸氫二銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀緩沖體系對菌體的促生長效果最好，因此選擇此緩沖鹽體系作為優(yōu)化培養(yǎng)基的緩沖鹽。

2.1.4 不同微量元素對活菌數(shù)的影響分別以硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、硫酸銅（CuSO4）、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）和硫酸錳（MnSO4·5H2O）等5種微量元素，加入不含硫酸鎂和硫酸錳的優(yōu)化培養(yǎng)基中，測定各培養(yǎng)基的活菌數(shù)。由圖4可知，硫酸錳和硫酸鋅對短乳桿菌的促生長作用最為突出，而硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸銅的作用較弱。微量元素可作為酶的激活劑或生物活性物質(zhì)的組成成分，對微生物的生長繁殖具有十分重要的作用，綜合考慮，選擇硫酸錳和硫酸鋅作為優(yōu)化培養(yǎng)基的微量元素。

圖3 不同緩沖鹽對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響

圖4 不同微量元素對L.brevis ZLB004活菌數(shù)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化主培養(yǎng)基

2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，各因素水平及主效應(yīng)分析見表2。由表2可以看出，在這9個因素的主效應(yīng)中，葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀和硫酸鋅對響應(yīng)值（活菌數(shù)）表現(xiàn)為正效應(yīng)，牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硫酸錳表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。其中酵母粉、牛肉膏和葡萄糖對響應(yīng)值有顯著影響（可信度大于95%，即主效應(yīng)P＜0.05），因此可作為顯著因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果根據(jù)P-B試驗(yàn)篩選出的顯著因素的效應(yīng)大小，確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可以看出，隨著酵母粉、牛肉膏質(zhì)量濃度降低、葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，活菌最高的響應(yīng)值區(qū)域在第4組試驗(yàn)，因此以第4組因素的水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，即酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.5 g/L。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及效應(yīng)分析

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值根據(jù)P-B試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)，以及Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3個因素為自變量，以短乳桿菌的活菌數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果確定試驗(yàn)中心和水平。試驗(yàn)因素與水平的選取見表4，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表5結(jié)果，用Minitab16軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到的回歸方程為：Y=3.21667+ 0.195X1+0.0675X2+0.0325X3-0.36208X12-0.23208X22-0.22208X32+0.0025X1X2-0.0225X1X3-0.0775X2X3。

式中：Y為短乳桿菌ZLB004菌體濃度的預(yù)測響應(yīng)值；X1、X2、X3分別為酵母粉、牛肉膏和葡萄糖的編碼值。

由表6可以看出，X1、X12、X22及X32對短乳桿菌活菌數(shù)有極顯著的影響（P＜0.01）。由表7可知，回歸方程P值為0.004，小于0.01，為非常顯著。模型失擬項(xiàng)P值為0.224，大于0.05，不顯著，說明所得數(shù)據(jù)擬合效果較好。相關(guān)系數(shù)R2= 0.9647，R2（調(diào)整）=0.9012，大于0.9，說明模型相關(guān)度很好。所以，能采用此模型來分析和預(yù)測短乳桿菌ZLB004的活菌數(shù)。

表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值

表7 回歸方程的方差分析

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，以確認(rèn)酵母粉、牛肉膏和葡萄糖3個因素對短乳桿菌ZLB004活菌數(shù)的影響，響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。由圖及軟件分析可知，所得擬合回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn)。根據(jù)Minitab軟件得到的回歸方程可計(jì)算得到，短乳桿菌活菌數(shù)的最大預(yù)測值為3.2×109cfu/mL，此時(shí)酵母粉質(zhì)量濃度為3.5 g/L，牛肉膏質(zhì)量濃度為8.5 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為31.4 g/L。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化培養(yǎng)基重復(fù)試驗(yàn)3次，發(fā)酵液中短乳桿菌ZLB004的平均活菌數(shù)為3.15×109cfu/mL，與響應(yīng)面預(yù)測的最大活菌數(shù)3.2×109cfu/mL接近，誤差為1.56%，這表明該模型能夠很好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。與優(yōu)化前的活菌數(shù)（7.85×108cfu/mL）相比，優(yōu)化后的活菌數(shù)提高了4.03倍，達(dá)到了優(yōu)化培養(yǎng)基的目的。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面分析圖與等高線圖

3 結(jié)論

以短乳桿菌ZLB004為試驗(yàn)菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，經(jīng)過單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，最終確定了最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：酵母粉3.5 g/L、牛肉膏8.5 g/L、葡萄糖31.4 g/L、牛肉蛋白胨10 g/L、無水乙酸鈉7.5 g/L、檸檬酸氫二銨3 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、硫酸錳0.2 g/L、硫酸鋅0.6 g/L、吐溫-80 1 mL/L。短乳桿菌ZLB004在此培養(yǎng)基中以1%接種量，37℃培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)可達(dá)到3.15×109cfu/mL，是優(yōu)化前活菌數(shù)的4.03倍，可以為短乳桿菌ZLB004的規(guī)模化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

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To optimize the fermentation medium of Lactobacillus brevis ZLB004，the effects of different carbon source，nitrogen source，buffer salts and microelement on the growth of Lactobacillus brevis were studied.The enrichment medium for Lactobacillus brevis was optimized by response surface methodology，and its composition was：glucose 31.4 g/L，yeast extract 3.5 g/L，beef extract 8.5 g/L，beef peptone 10 g/L，sodium acetate 7.5 g/L，diammonium hydrogen citrate 3 g/L，K2HPO43 g/L，MnSO4·5H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.6 g/L，Tween 80 1 ml/L，pH 6.5.After cultivated in enrichment medium for 24 h at 37℃，the living cells of Lactobacillus brevis ZLB004 were 3.15×109cfu/mL，which was about 4.03 times higher than previous optimization.

Lactobacillus brevis ZLB004；fermentation medium；response surface；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）11-0028-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171106

北京市科技計(jì)劃（Z141100002614002）；生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（BA1C02-2016）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QNJJ201408）

*通訊作者