不同中和劑對植物乳桿菌LP-C凍干菌粉制備的影響

謝萬勇，鮑志寧，黃秀敏，李學(xué)優(yōu)，文國波

(廣州市微生物研究所，廣東 廣州，510000)

不同中和劑對植物乳桿菌LP-C凍干菌粉制備的影響

謝萬勇，鮑志寧*，黃秀敏，李學(xué)優(yōu)，文國波

(廣州市微生物研究所，廣東 廣州，510000)

研究了氨水(NH3·H2O)、氫氧化鈉(NaOH)及碳酸鈉(Na2CO3)作為發(fā)酵中和劑對植物乳桿菌LP-C(以下簡稱LP-C)凍干菌粉制備的影響。研究中對高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中的活菌數(shù)、堿液消耗速率、細(xì)胞長度及凍干過程中的凍干存活率等參數(shù)進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果表明：(1)在高細(xì)胞密度培養(yǎng)階段，使用Na2CO3作為中和劑時(shí)，培養(yǎng)終點(diǎn)活菌數(shù)最高，可達(dá)到(1.31±0.08)×1010CFU/mL；各實(shí)驗(yàn)組堿液消耗速率變化趨勢基本一致，均是在培養(yǎng)前期0～6 h快速增長，之后逐步下降；各實(shí)驗(yàn)組菌體長度均隨培養(yǎng)時(shí)間推移逐漸減小，至培養(yǎng)終點(diǎn)，Na2CO3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞長度最小，為(1.05±0.13)μm；(2)在離心、凍干后，Na2CO3實(shí)驗(yàn)組獲得的凍干菌粉活菌數(shù)最高，為(5.17±0.27)×1011CFU/g，凍干存活率最高，為(89.31±0.74)%。由此可以得出，Na2CO3更合適作為中和劑應(yīng)用于LP-C凍干菌粉的制備，堿液消耗速率可作為判斷LP-C生長情況的間接指標(biāo)，較小的細(xì)胞形態(tài)更利于提高培養(yǎng)液活菌數(shù)和凍干存活率。

植物乳桿菌；中和劑；細(xì)胞長度；凍干菌粉；高細(xì)胞密度培養(yǎng)

益生菌(Probiotics)具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，預(yù)防和治療腹瀉，緩解腸道炎癥，治療乳糖不耐癥，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)等多方面的生理功能[1-4]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，市場需求的穩(wěn)定增加，益生菌在食品、保健、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等方面都有不同程度的研究應(yīng)用進(jìn)展[5-7]。而隨著美國發(fā)布“國家微生物組計(jì)劃(National Microbiome Initiative, NIMI)”，更多種類的益生菌及其作用機(jī)理將會(huì)被探討和研究。國際組織也越發(fā)重視生物保健益生菌制劑在不同領(lǐng)域的開發(fā)以及制劑安全性的探索。

隨著高細(xì)胞密度培養(yǎng)(High Cell Density Culture，HCDC)、分離和冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)化、高穩(wěn)定性的益生菌凍干菌粉為益生菌的廣泛應(yīng)用提供了橋梁和保證。因此對于如何提高益生菌培養(yǎng)液活菌數(shù)、凍干存活率、生產(chǎn)效率及存儲(chǔ)穩(wěn)定性已成為益生菌工業(yè)生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)。因此控制發(fā)酵過程中pH值穩(wěn)定，已成為實(shí)現(xiàn)HCDC的普遍手段。呂兵等[8]研究表明，在保加利亞乳桿菌HCDC過程中pH的控制可解除乳酸濃度不斷提高對乳酸菌自身增殖的抑制作用，從而獲得更高濃度的細(xì)胞培養(yǎng)物。Antonis等[9]研究表明，發(fā)酵過程中控制恒定的pH值，有利于提高鼠李糖乳桿菌LGG培養(yǎng)過程中糖代謝的速率，進(jìn)而可提供足夠的ATP來保持細(xì)胞活性，加快菌體增殖和可提高LGG在凍干過程中的存活率。同時(shí)穩(wěn)定的pH控制也有利于提高HCDC獲得產(chǎn)物的穩(wěn)定性，如表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定性、收獲活細(xì)胞的活性等[10]。目前尚未有對于不同中和劑對益生菌HCDC過程及后續(xù)凍干菌粉制備影響的報(bào)道。

本課題以植物乳桿菌LP-C(以下簡稱LP-C)為研究對象，對比在控制恒定pH的HCDC中，NH3·H2O、NaOH及Na2CO3三種中和劑對凍干菌粉制備的影響。研究中通過考察凍干菌粉制備過程中HCDC活菌數(shù)變化、菌體形態(tài)變化、堿液消耗速率及凍干存活率等參數(shù)，以期尋找出一種可提高LP-C HCDC活菌數(shù)和凍干存活率的中和劑并初步解析其作用機(jī)理，為益生菌的工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

LP-C(lactobacillusplantarumC)，由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保藏(GW-4-1201-1612-04)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：50L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司；pH電極，METTLER TOLEDOCo.Ltd；超凈工作臺(tái)，江蘇凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器股份有限公司；顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；管式離心機(jī)，上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；凍干機(jī)，杭州創(chuàng)意冷凍干燥設(shè)備有限公司。

主要試劑：脫脂乳粉，新西蘭恒天然乳品有限公司，食品級(jí)；大豆分離蛋白，山東萬得福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，食品級(jí)；葡萄糖，秦皇島驪驊淀粉股份有限公司，食品級(jí)；酵母粉，湖北安琪酵母股份有限公司，食品級(jí)；VC，山東西唐生物科技有限公司，食品級(jí)；司盤S-80，廣州市匯科科技，食品級(jí)，其他試劑為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基[11]

脫脂乳粉(50 g/L)、大豆分離蛋白(8 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、酵母浸膏(8 g/L)、NaCl(23 g/L)、MgSO4·7H2O(2 g/L)、MnSO4·H2O(0.05 g/L)、司盤S-80(1 g/L)、氫氧化胺(0.5 g/L)，調(diào)節(jié)pH5.80,121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 凍干保護(hù)劑[11]

脫脂乳粉(20 g/L)，谷氨酸鈉(20 g/L)，海藻糖(40 g/L)，麥芽提取物(30 g/L)。

目前雖然尚未研發(fā)出針對非洲豬瘟的疫苗。但高溫、消毒劑可以有效殺滅病毒，因此，確保生物安全成為最重要的防線。泔水是一種方便、成本低廉，但存在高風(fēng)險(xiǎn)的飼料，可能含有多種病原。多項(xiàng)研究表明，食用被病毒污染的泔水是非洲豬瘟傳播的重要方式之一。因此，必須禁止用泔水和含有豬肉的食物殘羹飼喂生豬。

1.4 方法與步驟

1.4.1 LP-C凍干菌粉制備工藝流程[11]

1.4.2 凍干粉存活率計(jì)算

(1)

式中：FS為凍干存活率，%；C1為凍干菌粉活菌數(shù)，CFU/g；M1為凍干菌粉質(zhì)量，g；C2為凍干前菌懸液活菌數(shù)，CFU/g；M2為凍干前菌懸液質(zhì)量，g。

1.4.3 活菌計(jì)數(shù)

參考國標(biāo)GB4789.35—2010。

(2)

式中：V堿，堿液消耗速率，g/min；M1，堿液初始質(zhì)量，g；M2，培養(yǎng)一定時(shí)間后堿液質(zhì)量，g，t，培養(yǎng)時(shí)間間隔，min。

1.4.5 細(xì)胞長度測量

在光學(xué)顯微鏡100倍油鏡下，采用OPTPro金相系統(tǒng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞長度測量與記錄，每個(gè)樣品做3個(gè)鏡片，每個(gè)鏡片測量10個(gè)細(xì)胞的長度，單位μm。

1.4.6 分析方法

作圖軟件采用Excel2010，數(shù)據(jù)處理采用SPSS23.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細(xì)胞增殖的影響

圖1顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中細(xì)胞增殖的影響，可以看出各實(shí)驗(yàn)組菌體增殖趨勢基本一致，在培養(yǎng)前0～4.5h，菌體快速增殖，處于對數(shù)生長期；在培養(yǎng)后4.5～9 h，菌體增殖速度緩慢，進(jìn)入平穩(wěn)期；至培養(yǎng)終點(diǎn)，Na2CO3實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)最高，達(dá)到(1.31±0.08)×1010CFU/mL，與NH3·H2O實(shí)驗(yàn)組及NaOH實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of cell proliferation in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

這是由于相比與NaOH和NH3·H2O，Na2CO3作為中和劑時(shí)，其與乳酸反應(yīng)后產(chǎn)生CO2，而CO2的存在將進(jìn)一步降低培養(yǎng)液中的溶氧水平，進(jìn)而更利于屬于兼性厭氧型LP-C的生長。而NH3·H2O作為中和劑的同時(shí)也是一種速效氮源，在培養(yǎng)前期，菌體生長緩慢，產(chǎn)酸量低，NH3·H2O添加量少，此時(shí)培養(yǎng)液中碳氮比基本維持在初始培養(yǎng)基的水平，菌體增殖正常；但是在進(jìn)入對數(shù)后期后，菌體快速增殖，原始培養(yǎng)基中碳源氮源不斷消耗，產(chǎn)酸速率加快，NH3·H2O添加量增加，增加了培養(yǎng)液中氮源，從而降低了培養(yǎng)液的碳氮比，進(jìn)而不利于菌體的進(jìn)一步增殖。這與高磊等[12]研究類似，其在研究不同碳氮比對乳酸菌生長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)較高的碳氮比(C∶N≥10)更適合乳酸菌的生長。NaOH作為中和劑時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)液中Na+濃度不斷提高，至培養(yǎng)中后期，過高的鹽離子將抑制菌株的生長[13]。

2.2 不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響

微生物發(fā)酵是一個(gè)不斷消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，經(jīng)過微生物細(xì)胞代謝合成菌體生長所需產(chǎn)物的過程，而營養(yǎng)成分的減少、代謝產(chǎn)物的增加將使培養(yǎng)液中的酸度不斷變化，因此培養(yǎng)液酸度作為微生物發(fā)酵過程中一個(gè)重要的監(jiān)測參數(shù)，其可以間接的反映發(fā)酵液中營養(yǎng)成分的消耗情況、代謝產(chǎn)物的生成情況及菌體的增殖情況[14]。而在恒定pH高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中，與酸度變化直接相關(guān)的即中和劑的添加速率和添加量，可根據(jù)中和劑的添加情況判斷菌體生長情況。

圖2顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響，可以看出各實(shí)驗(yàn)組堿液消耗速率變化趨勢基本一致，并與菌體生長的變化趨勢基本一致，在培養(yǎng)前0～2h，菌體生長處于遲滯期，堿液消耗速率緩慢；在培養(yǎng)2～6.5 h，菌體生長處于對數(shù)期，堿液消耗速率加快；在培養(yǎng)6.5～9.5 h，菌體生長處于平穩(wěn)期，堿液消耗速率緩慢下降。對培養(yǎng)過程中堿液消耗的記錄及乳酸產(chǎn)量的計(jì)算(表1)，可以看出，NH3·H2O實(shí)驗(yàn)組與Na2CO3實(shí)驗(yàn)組乳酸生成量沒有顯著差異，NaOH實(shí)驗(yàn)組乳酸生成量最低與其余兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組存在顯著性差異，由此可以看出NaOH實(shí)驗(yàn)組碳源代謝率最低，而結(jié)合高細(xì)胞密度培養(yǎng)活菌數(shù)來看，NaOH實(shí)驗(yàn)組的放罐活菌數(shù)也是最低，進(jìn)而可以看出在LP-C的高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中，碳源的高效率代謝對活菌數(shù)的增加至關(guān)重要。

圖2 不同中和劑對LP-C HCDC過程中堿液消耗速率的影響Fig.2 Effect of alkali consumption rate in the process of LP-CHCDC with different neutralizer

項(xiàng)目堿液消耗量/mol乳酸生成量/molNH3·H2O實(shí)驗(yàn)組10.19±0.18a10.19±0.18bNaOH實(shí)驗(yàn)組9.39±0.22b9.39±0.22aNa2CO3實(shí)驗(yàn)組4.99±0.09c9.99±0.90b

注：a、b、c表示同一列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同中和劑對LP-C HCDC過程中菌體形態(tài)的影響

微生物細(xì)胞在不同的培養(yǎng)基中[15]、不同的生長階段[16]及不同的生長環(huán)境中[17]，細(xì)胞形態(tài)會(huì)不同。圖3和圖4顯示了不同中和劑對LP-C HCDC過程中細(xì)胞長度的影響，由圖可以看出，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大小均隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，菌體長度在逐步減小；在培養(yǎng)前1.5～6.0h(對數(shù)生長期)，細(xì)胞長度迅速減小，在培養(yǎng)6.0～9.5h(穩(wěn)定期)，細(xì)胞長度減小速度減慢。相比于培養(yǎng)1.5h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組HCDC結(jié)束時(shí)，細(xì)胞長度分別下降了(62.05±0.35))%、(62.00±0.31)%和(67.81±0.18)%，并且至培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)，Na2CO3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞長度最小，為(1.05±0.13)μm，與其余兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組存在顯著性差異。由此可以看出，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均隨培養(yǎng)時(shí)間的推移細(xì)胞長度逐漸變小，分析可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，培養(yǎng)液中細(xì)胞總量不斷增加，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分不斷被消耗，至培養(yǎng)后期菌體之間營養(yǎng)和空間競爭加劇，細(xì)胞生長不是足夠充分；并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，培養(yǎng)液中乳酸鹽濃度不斷增加，培養(yǎng)液滲透壓也不斷增加，為了維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，細(xì)胞失水收縮，進(jìn)而細(xì)胞體積也會(huì)隨之減小[18]。

圖3 不同中和劑對LP-C HCDC過程中細(xì)胞長度的影響Fig.3 Effect of cell length in the process of LP-C HCDC with different neutralizer

圖4 不同中和劑HCDC過程中不同時(shí)期菌體鏡檢圖Fig.4 The microscopic examination of the bacteria in the process of HCDC with different neutralizer in different periods

2.4 不同中和劑對LP-C凍干菌粉制備的影響

離心菌體分離及冷凍干燥獲得菌粉作為益生菌菌粉制備過程中的關(guān)鍵步驟，對其品質(zhì)有著重要影響。從表2中可以看出，3組實(shí)驗(yàn)中的菌泥重量、菌懸液重量及凍干菌粉重量均沒有顯著差異；冷凍干燥后，Na2CO3實(shí)驗(yàn)組凍干存活率最高，為(89.31±0.74)%，與NH3·H2O實(shí)驗(yàn)組及NaOH實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異；并且獲得凍干菌粉的活菌數(shù)也是Na2CO3實(shí)驗(yàn)組最高，達(dá)到(5.17±0.27)×1011cfu/g，與NH3·H2O實(shí)驗(yàn)組及NaOH實(shí)驗(yàn)組存在顯著差異。由此可以看出，不同中和劑的使用不僅對LP-C HCDC過程存在影響，而且對其后期菌粉制備也有較大影響，使用Na2CO3作為中和劑時(shí)，HCDC獲得菌體細(xì)胞活力更高，在整個(gè)凍干菌粉制備過程中活細(xì)胞損失率更小。結(jié)合HCDC過程中細(xì)胞形態(tài)的變化及凍干菌粉細(xì)胞長度來看，長度更小的細(xì)胞更利于提高冷凍干燥過程的凍干存活率和獲得活菌數(shù)更高的凍干菌粉。Carvalho等[19]研究表明，在凍干過程中，短小的細(xì)胞受到冰晶的損傷更小，更利于提高凍干存活率和保持細(xì)胞活力。并且Martin等[20]在研究不同培養(yǎng)基組成對嗜酸乳桿菌NCFM HCDC的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)短小的細(xì)胞比長細(xì)胞更加穩(wěn)定，并且在凍干及儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性更高。本課題首次將細(xì)胞長度變化與LP-CHCDC過程及凍干過程相結(jié)合，結(jié)果表明細(xì)胞長度可作為益生菌凍干菌粉制備過程中一個(gè)重要的參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測。

表2 離心及凍干過程中數(shù)據(jù)記錄

注：a、b、c表示同一列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

表3 離心及凍干過程中活菌數(shù)記錄

注：a、b、c表示同一列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

圖5 不同中和劑HCDC凍干菌粉鏡檢圖Fig.5 The microscopic examination of the freeze-dried bacteria powder in the process ofhigh density culture with different neutralizer

3 結(jié)論

在50L發(fā)酵罐水平探討了NH3·H2O、NaOH及Na2CO3作為中和劑時(shí)對LP-C凍干菌粉制備的影響。通過對制備過程中活菌數(shù)、pH變化率、堿液消耗速率、細(xì)胞形態(tài)變化及凍干存活率等參數(shù)分析可得出以下結(jié)論：(1)3種中和劑中Na2CO3更適合作為LP-C HCDC的中和劑，相比于NH3·H2O和NaOH，使用Na2CO3時(shí)的安全性更高、成本更低，將更加有利于LP-C的工業(yè)化生產(chǎn)；(2)在LP-C HCDC過程中可以堿液消耗速率作為移種、補(bǔ)料及培養(yǎng)終點(diǎn)的參數(shù)指標(biāo)；(3)在LP-C HCDC過程中，細(xì)胞長度在逐漸變小，并且較小的細(xì)胞形態(tài)有利于提高益生菌培養(yǎng)液活菌數(shù)和凍干存活率。

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Effect of different fermentation neutralizer on preparation ofLactobacillusplantarumLP-C lyophilization powder

XIE Wan-yong, BAO Zhi-ning*, HUANG Xiu-min, LI Xue-you, WEN Guo-bo

(Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510000, China)

This article studied the effect of ammonia (NH3·H2O), sodium hydroxide (NaOH) and sodium carbonate (Na2CO3) as fermentation neutralizer on preparation of plant Lactobacillus LP-C lyophilization powder. In this study, viable count, neutralizer consumption rate, cell length and lyophilization survival rate were be monitored during the process of high density culture and lyophilization. The results showed that, the highest number of living bacterium reached (1.31+0.08)×1010CFU/mL at the stage of high cell density cultivation (HCDC) with Na2CO3as a neutralizer. The change trend of alkali consumption rate was substantially identical among all experimental groups, which was fast at the early stage of culture (0-6 h) and decline gradually at the late culture stage (6-9.5 h). The length of cells in each experiment decline gradually during the process of HCDC, and the minimum cell length reached (1.05 + 0.13) μm when using Na2CO3as a neutralizer. After centrifugation and lyophilization, the highest number of living bacterium of lyophilization powder reached (5.17±0.27)×1011and the highest lyophilization survival rate reached (89.31±0.74)% when using sodium carbonate as a neutralizer. In conclusion, sodium carbonate was a more suitable neutralizer for lyophilization powder preparation of LP-C. Alkali consumption rate can be used as indirect indicator of growth of LP-C. Smaller cell length is more conducive to improve the number of living bacterium during fermentation and survival rate after lyophilization.

Lactobacillusplantarum；cell length；neutralizer；lyophilization powder; high cell density culture

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705020

碩士研究生(鮑志寧博士為通訊作者,E-mail：janinebao@gmail.com)。

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新聯(lián)盟專題“益生菌資源庫建設(shè)及產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究和應(yīng)用示范”；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目技術(shù)交易體系與科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)領(lǐng)域“廣州市生物科技園科技創(chuàng)業(yè)服務(wù)平臺(tái)建設(shè)”(2015B040403004)

2016-10-11，改回日期：2017-01-07