張龍云，張聰芝，李燕榮，蒲 春

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

芝麻香曲中功能酵母菌的初步研究

張龍云，張聰芝，李燕榮，蒲 春

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

采用稀釋涂布法，從酒醅、大曲及環(huán)境中篩選到29株酵母菌，從中進一步的篩選出11株酵母菌為研究對象，進行研究。同時，將11株菌株按照等比混合應用于芝麻香曲的生產，確定發(fā)酵培養(yǎng)條件。結果表明，酵母菌曲的最適培養(yǎng)條件為水分53%，pH5.0，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)時間36 h。

芝麻香曲； 功能酵母菌； 等比混合

芝麻香型白酒對我國白酒發(fā)展作出了重大的貢獻，是一種高檔次的白酒。芝麻香型白酒具有典型的復合焦香特性[1]，對改善酒體綿柔度和豐滿感有重要作用。

芝麻香曲是生產芝麻香型白酒的關鍵環(huán)節(jié)，曲質的好壞直接影響酒的品質[2]。在芝麻香型白酒的釀造過程中，復合生香酵母是除白曲外的第二類重要微生物[3]。芝麻香型白酒的釀造過程中應用的復合酵母主要有釀酒酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬和漢遜氏酵母屬等。各種酵母按照一定比例混合培養(yǎng)，制成復合菌系，為芝麻香風味形成提供了豐富的物質基礎。

為進一步探索功能微生物在芝麻香曲生產中的應用，對應用于芝麻香曲生產的功能酵母進行系統(tǒng)研究，為研究芝麻香型白酒的風味物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與儀器

材料：酒醅和大曲作為樣品，從中進行篩選。

培養(yǎng)基：酵母平板及斜面培養(yǎng)基為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；酵母種子培養(yǎng)基為麥芽汁液體培養(yǎng)基；酵母麩皮培養(yǎng)基為麩皮加適量無機鹽培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基滅菌條件為121℃滅菌20 min；麩皮培養(yǎng)基滅菌條件為121℃滅菌20 min。

儀器[4]：HS-3E臺式pH計，LDZH-200KBS立式滅菌鍋，DNP-9162A電熱恒溫培養(yǎng)箱，島津氣質聯(lián)用儀，HW-150C溫控振蕩培養(yǎng)箱，90-3恒溫雙向磁力攪拌器，BP20奧林巴斯顯微鏡，血球計數(shù)板。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理和菌懸液的制備

將采集得到的樣品采用四分法混合均勻后，-4℃冰箱保存?zhèn)溆?。稱取混合樣品1 g，倒入裝有99 mL滅菌去離子水和玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩30 min，制成菌懸液，然后靜置澄清，取上清液作10倍逐級稀釋至適當倍數(shù)。

1.2.2 酵母的分離、純化和鑒定

取菌懸液，梯度稀釋至適宜濃度，涂布于麥芽汁瓊脂平板，30℃培養(yǎng)24 h，選取不同菌落特征的酵母菌純化獲得純菌種，并參照《真菌鑒定手冊》[5]和《微生物學分類》[6]初步鑒定，保存于斜面培養(yǎng)基中。

1.2.3 分析方法

pH值采用全自動pH計測定；微量風味物質采用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質聯(lián)用（HS-SPME-GCMS）進行定性定量分析[7]；發(fā)酵力、總酸和總酯測定方法參照沈怡方主編的《白酒生產技術全書》。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的分離、純化和鑒定

2.1.1 酵母菌的分離、純化

利用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基從大曲和酒醅進行分離，共篩選到29株酵母菌。進一步利用麥芽汁液體結合麩曲固態(tài)培養(yǎng)進行篩選，以發(fā)酵產酯能力和淀粉出酒率為指標（見表1），共篩選出11株酵母，用于芝麻香酵母復合曲的生產。

表1 11株酵母產酯和出酒能力

2.1.2 酵母菌的鑒定

酵母的鑒定主要依據(jù)菌落形態(tài)，同時結合生理生化特性。依據(jù)上述特征初步分離得到的酵母菌分為4個屬，分別為釀酒酵母屬（Saccharomyces spp.）、假絲酵母屬（Candida spp.）、畢赤酵母屬（Pichia spp.）和漢遜氏酵母屬（Hansenula spp.）。圖1和圖2為酵母菌群落和顯微鏡下的照片。

圖1 部分酵母菌群落形態(tài)圖

圖2 部分酵母菌形態(tài)顯微鏡圖片

2.2 酵母菌液態(tài)培養(yǎng)感官特征和理化特性

11株酵母菌以麥芽汁液體培養(yǎng)基，經過多次發(fā)酵試驗，發(fā)酵液表面會形成白色膜，感官檢查結合聞香，可聞到甜味，類似香蕉和蘋果等的水果香味，有的略帶酸味等其他氣味，但每株酵母的產香又有區(qū)別。11株酵母感官特征見表2。

表2 11株酵母感官特征

同時，各酵母菌產酒精和產酯能力也不同（見表3）。將11株酵母等比進行混合，制備酵母麩曲，可有效提高芝麻香曲的發(fā)酵力以及酯化力。結合OD值法，酵母在經過2～3 h延滯期后迅速進入對數(shù)期，9 h后進入穩(wěn)定期。

2.3 功能性酵母菌固態(tài)發(fā)酵風味物質定性分析

通過純種液態(tài)培養(yǎng)功能性酵母菌種子液，然后接種到固態(tài)麩皮培養(yǎng)基中進行單菌種固態(tài)發(fā)酵，研究單個酵母菌風味物質形成情況；運用頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用的方法進行定性分析。

酵母在風味物質數(shù)量和種類上較少，風味物質數(shù)量最多的是4#菌。其中5#酵母產β-苯乙醇含量最，高達到了24.67×10-10g/g，愈創(chuàng)木酚含量最高的是4#酵母，達到了98.43×10-10g/g，并且高級醇及高級脂肪酸酯含量較為豐富。

表3 11株酵母其他理化特征

表4 11株酵母菌部分風味物質 (×10-10g/g)

2.4 酵母菌固態(tài)培養(yǎng)條件的研究

根據(jù)上述的研究，將11株酵母菌等比進行混合，采用單因素法對影響芝麻香酵母曲的培養(yǎng)條件進行研究。

2.4.1 水分的影響

將培養(yǎng)好的11株酵母菌混合菌液，按照10%接種量接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h，考察麩皮水分對酵母菌曲的影響。

水分對發(fā)酵力和菌體濃度的影響見圖3。由圖3可知，隨著麩皮水分的增加，酵母發(fā)酵力和菌體數(shù)量級呈先上升后下降趨勢；當水分達到53%時，發(fā)酵力和菌體數(shù)量級均達到了最大值，結合生產實際經驗，確定酵母曲培養(yǎng)麩皮水分為53%。

圖3 水分對發(fā)酵力和菌體濃度的影響

2.4.2 pH值的影響

將培養(yǎng)好的11株酵母菌混合菌液，按照10%接種量接種于含水53%的麩皮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h，考察pH值對細菌曲的影響。pH值對酵母發(fā)酵力和菌體濃度的影響見圖4。

由圖4可知，隨著物料pH值的上升，酵母發(fā)酵力和菌體數(shù)量呈現(xiàn)數(shù)量級上升趨勢；當入盤pH5.0時，發(fā)酵力和菌體數(shù)量級均達到了最大值，確定了酵母曲培養(yǎng)最適pH值為5.0。

2.4.3 培養(yǎng)溫度的影響

將11株酵母菌混合菌液，按照10%接種量接種于含水53%的麩皮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h,考察培養(yǎng)溫度對酵母菌曲的影響。培養(yǎng)溫度對酵母發(fā)酵力和菌體濃度的影響見圖5。

由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度的上升，酵母發(fā)酵力和菌體數(shù)量級均呈現(xiàn)上升趨勢，當培養(yǎng)溫度為28～32℃時，發(fā)酵力和菌體數(shù)量級變化不明顯，此次培養(yǎng)溫度試驗和酵母理論最適培養(yǎng)溫度吻合。

圖4 pH值對發(fā)酵力和菌體濃度的影響

圖5 溫度對發(fā)酵力和菌體濃度的影響

2.4.4 培養(yǎng)時間的影響

將11株酵母菌混合菌液，按照10%接種量接種于含水53%的麩皮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度32℃,進行培養(yǎng)，考察培養(yǎng)時間對酵母菌曲的影響。培養(yǎng)時間對酵母發(fā)酵力和菌體濃度的影響見圖6。

由圖6可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母發(fā)酵

力和菌體數(shù)量級呈現(xiàn)上升趨勢；當培養(yǎng)時間為36 h時，發(fā)酵力和菌體數(shù)量級均達到了頂峰，隨著時間的延長，酵母菌濃度保持一定數(shù)量級，但是發(fā)酵力下滑。

圖6 培養(yǎng)時間對發(fā)酵力和菌體濃度的影響

3 結論

3.1 利用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基通過初篩得到29株酵母菌，進一步利用麥芽汁液體結合麩曲固態(tài)培養(yǎng)進行篩選，通過測定發(fā)酵產酯能力和淀粉出酒率共篩選出11株酵母菌，用于芝麻香酵母復合曲的生產；同時結合生理生化特征初步鑒定，分離得到酵母菌4個屬：釀酒酵母屬（Saccharomyces spp.）、假絲酵母屬（Candida spp.）、畢赤酵母屬（Pichia spp.）和漢遜氏酵母屬（Hansenula spp.）。

3.2 對11株酵母菌的固態(tài)發(fā)酵風味物質進行了分析。酵母在風味物質數(shù)量和種類上較少，風味物質數(shù)量最多的是4#菌。其中5#酵母β-苯乙醇含量最高，為24.67×10-10g/g，愈創(chuàng)木酚含量最高的是4#酵母，為98.43×10-10g/g，并且高級醇及高級脂肪酸酯含量較為豐富。

3.3 確定了11株酵母菌等比混合下單因素固態(tài)培養(yǎng)的條件：酵母菌曲的最適培養(yǎng)條件為水分53%，pH5.0，培養(yǎng)溫度32℃，培養(yǎng)時間36 h。

[1] 張應蓮,鐘方達,胡峰,等.貴州特色芝麻香型白酒工藝特點及成分分析[J].釀酒科技,2013(12)：13-16.

[2] 沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2007.

[3] 王瑞明.芝麻香型白酒生產關鍵微生物的功能分析[D].淄博：山東輕工業(yè)學院,2011

[4] 王耀,張聰芝,李浩,等.綿柔型白酒釀造用復合功能曲多微體系分析研究[J].釀酒科技,2015(4)：41-45.

[5] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社, 1979.

[6] 黃靜娟.微生物分類學[M].上海：復旦大學出版社, 1990.

[7] 張春林,敖宗華,炊偉強,等.頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用快速測定大曲中的揮發(fā)性風味成分[J].食品科學, 2011,32(10)：137-140.

Preliminary Research on Functional Yeast Strains in Zhimaxiang Qu

ZHANG Longyun,ZHANG Congzhi,LI Yanrong and PU Chun
（Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China）

In the experiment,29 yeast strains were isolated from fermented grains,Daqu and liquor-making environment with dilution method,and 11 yeast strains among them were further screened out for the research.The equal mixture of the 11 yeast strains was used in the production of Zhimaxiang Qu and the optimum fermenting conditions were determined as follows:moisture content was 53%,pH5.0,fermenting temperature was at 32℃,and fermenting time was 36 h.

Zhimaxiang Qu;functional yeast strains;equal mixture

TS261.1；TQ925.7；TS262.3

A

1001-9286（2017）06-0044-05

10.13746/j.njkj.2017060

2017-03-16

張龍云（1982-），黑龍江省人，碩士，工程師，主要從事功能微生物研究工作。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-05-03；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170503.1032.002.html。