魏明，甘露，龍衛(wèi)紅，侯進(jìn)，鄧雅婷，陳玉龍，陳麗宏

1. 西安醫(yī)學(xué)院藥理毒理學(xué)教研室，西安 7100212. 陜西省人民醫(yī)院婦科，西安 7100683. 西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，西安 710021

蘇丹紅I對(duì)小鼠卵巢的損傷作用及對(duì)Caspase-3和Ki-67表達(dá)的影響

魏明1,*，甘露2，龍衛(wèi)紅2，侯進(jìn)1，鄧雅婷1，陳玉龍3，陳麗宏2

1. 西安醫(yī)學(xué)院藥理毒理學(xué)教研室，西安 7100212. 陜西省人民醫(yī)院婦科，西安 7100683. 西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，西安 710021

蘇丹紅是一種人工合成偶氮染料，可引起肝臟及泌尿系統(tǒng)等多個(gè)臟器的腫瘤，但蘇丹紅對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性研究較少。本研究以昆明小鼠為受試對(duì)象，探討蘇丹紅I對(duì)小鼠卵巢組織Caspase-3和Ki-67表達(dá)的影響。將24只昆明小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、低劑量(60 mg·kg-1)、中劑量(120 mg·kg-1)、高劑量(240 mg·kg-1) 4組，6只/組。胃灌4周，4周末處死。HE染色觀察各組卵巢組織病理變化，免疫組化法檢測(cè)卵巢組織Caspase-3和Ki-67表達(dá)，Real time PCR檢測(cè)卵巢組織Caspase-3和Ki-67 mRNA表達(dá)，Western blotting檢測(cè)卵巢組織中Ki-67及Caspase-3蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組卵巢中Caspase-3陽性細(xì)胞率顯著升高(P<0.05)，而Ki-67陽性細(xì)胞率顯著降低(P<0.05)，Real time PCR及Western blotting結(jié)果與免疫組化法結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘇丹紅染毒后顆粒細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)增加，且Caspase-3表達(dá)呈劑量依賴性，但Ki-67表達(dá)受到抑制。

蘇丹紅I；卵巢；Caspase-3；Ki-67

蘇丹紅(Sudan)是一種人工合成偶氮染料，廣泛用于化妝品、蠟類、溶劑、紡織品等[1]。當(dāng)前，蘇丹紅不允許用于食物，但在過去的10年中，蘇丹紅仍然在歐洲進(jìn)口的食物中被發(fā)現(xiàn)[2]。許多國家立法要求在進(jìn)口食物中檢測(cè)蘇丹紅的水平(SudanI, II, III和IV)[2]。在國內(nèi)，一些不法商販仍違規(guī)使用蘇丹紅，如將蘇丹紅IV添加到辣椒粉中，借以刺激人們的感官并增進(jìn)食欲，嚴(yán)重威脅食用者的身體健康。文獻(xiàn)報(bào)道，蘇丹紅I可以引起肝臟以及泌尿系統(tǒng)等多個(gè)臟器的腫瘤，此外，Sudan進(jìn)入體內(nèi)后激活相關(guān)酶體系，在酶的催化作用下形成多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)核物質(zhì)的損傷，或與DNA、RNA形成加合物，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了Sudan的致突變作用[3-5]。研究報(bào)道，Caspase-3是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要執(zhí)行分子之一，其激活后導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆性凋亡[6]。而Ki-67是一種能識(shí)別存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，能反映組織細(xì)胞的增殖活性[7]。本研究以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過免疫組化、實(shí)時(shí)定量RCR及Western blotting技術(shù)，檢測(cè)卵巢組織Caspase-3及Ki-67表達(dá)，探討蘇丹紅I對(duì)小鼠卵巢組織的影響，確定其對(duì)小鼠生殖的毒性，以期為研究蘇丹紅Ⅰ的毒性和毒理作用提供參考，為全面評(píng)價(jià)蘇丹紅的毒性和毒理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

蘇丹紅I(SDI)購自第四軍醫(yī)大學(xué)試劑中心；10周齡體重21～22 g健康昆明小鼠，購自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，保持恒溫(22 ℃±2 ℃)，恒濕(55%±5%)，照明情況為12 h∶12 h(光照∶黑暗)。每籠6只，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水?dāng)z食。Caspase-3大鼠抗小鼠多克隆抗體與Ki-67兔抗鼠多克隆抗體購自CST公司，即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，低、中、高3個(gè)劑量SDI實(shí)驗(yàn)組，每組隨機(jī)分6只雌性昆明小鼠。實(shí)驗(yàn)組每日分別給小鼠胃灌0.2 mL濃度分別為60、120和240 mg·kg-1的SDI植物油，對(duì)照組小鼠胃灌0.2 mL植物油溶液，連續(xù)胃灌28 d[8]。

1.2.2 標(biāo)本收集及HE染色

小鼠給藥4周后處死。卵巢組織迅速置于10%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，60 ℃埋蠟。萊卡切片機(jī)切片，HE染色，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 免疫組化

按照免疫組化常規(guī)步驟操作。切片脫蠟至水，6%(體積分?jǐn)?shù))H2O2-甲醇溶液浸泡去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加正常羊血清(體積比為1∶10)，置濕盒37 ℃孵育20 min，棄血清，用1∶100(體積比)稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育1 h，滴加HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，DAB反應(yīng)液中止顯色，上述各步驟之間均用0.01 mol·L-1、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次5 min。蘇木素復(fù)染，透明封片。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色細(xì)顆粒狀物質(zhì)沉積，則為細(xì)胞核陽性反應(yīng)，細(xì)胞核免疫陽性產(chǎn)物為清晰點(diǎn)狀。若細(xì)胞核周圍見棕黃色顆粒狀物質(zhì)沉積，則可判斷為細(xì)胞漿陽性反應(yīng)。通過免疫組化檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3及Ki-67表達(dá)情況。

1.2.4 圖像分析及處理

Caspase-3以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為凋亡陽性細(xì)胞，而Ki-67檢測(cè)以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色即為增殖細(xì)胞，每張切片從左至右連續(xù)觀察10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)Caspase-3及Ki-67表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，即分別為Caspase-3陽性細(xì)胞率和Ki-67陽性細(xì)胞率。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組卵巢組織Caspase-3和Ki-67 mRNA水平

收集各組卵巢組織，用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后定量備用，取10 μL體系進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系為：上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，PCR Mix 5 μL，ddH2O 3.2 μL。Primer5.0設(shè)計(jì)引物。

β-actin上游引物為5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’,下游引物為5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’；Caspase-3上游引物為5’-TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3’,下游引物為5’-CCAGTGTCCAGCCCATGATG-3’。

Ki-67上游引物為5’-AGCGTCAACAGGGAGATG-3’, 下游引物為5’-CTTCAGAGACAGCCAGGAG-3’。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)各組卵巢組織中Ki-67及Caspase-3蛋白水平

取小鼠新鮮卵巢組織，提取蛋白后蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，8%(體積分?jǐn)?shù))牛奶封閉2 h，Ki-67、Caspase-3、β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，HRP標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光，曝光后掃描，以目的條帶和內(nèi)參照條帶β-actin灰度比值表示Ki-67 Caspase-3蛋白水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 SDI對(duì)小鼠卵巢損傷的病理結(jié)果

SDI低劑量組HE染色與對(duì)照組比較，形態(tài)無明顯差異，卵巢體積以及皮質(zhì)各級(jí)卵泡基本正常，顆粒細(xì)胞無明顯變化；中劑量組小鼠的卵巢體積縮小，皮質(zhì)萎縮，各級(jí)卵泡均可見；高劑量組部分區(qū)域可見纖維組織增生，有間質(zhì)小血管擴(kuò)張充血，嚴(yán)重者卵巢皮質(zhì)明顯變薄，結(jié)構(gòu)混亂，間質(zhì)纖維化，卵泡數(shù)量明顯減少，閉鎖卵泡增多，成熟卵泡幾乎不可見，黃體細(xì)胞明顯增大變空，部分顆粒細(xì)胞水變性更明顯。

2.2 SDI對(duì)小鼠卵巢Caspase-3及Ki-67表達(dá)的影響

Caspase-3蛋白陽性信號(hào)主要位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)核陽性，如圖2所示。高劑量及中劑量Caspase-3的陽性率分別為55.39%±3.66%及31.25%±5.41%，與對(duì)照組比較，Caspase-3在中高劑量卵巢組織中表達(dá)明顯增加(P<0.05)。Ki-67蛋白的陽性信號(hào)主要位于細(xì)胞質(zhì)，高劑量及中劑量的Ki-67蛋白陽性率分別為14.81%±2.17%及19.95%±3.22%。與對(duì)照組比較，Ki-67在SDI高劑量組卵巢組織中表達(dá)明顯降低(P<0.05)見圖2，表1。

表1 各組卵巢中Ki-67及Caspase-3陽性細(xì)胞率Table 1 The rate of Ki-67 and Caspase-3 positive cell in ovary of each group (±s, n=6)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低濃度組比較，#P<0.05。

Note: * compared with the control group, P<0.05； # compared with low concentration group, P<0.05.

圖1 小鼠卵巢HE染色圖(×200)(n=6)注：A-對(duì)照組，B-蘇丹紅I(SDI)中濃度組(120 mg·kg-1)，C-SDI高濃度組(240 mg·kg-1)。Fig. 1 Mouse ovarian HE staining (×200)(n=6)Note: A-Control, B-Sudan I (SDI) median concentration group (120 mg·kg-1), C-SDI high concentration group (240 mg·kg-1).

圖2 小鼠卵巢Ki-67及Caspase-3表達(dá)(×400)(n=6)注：A，Ki-67在對(duì)照組中的表達(dá)；B，Ki-67在SDI中濃度組中的表達(dá)；C，Ki-67在SDI高濃度組中的表達(dá)；D，Caspase-3在對(duì)照組中的表達(dá)；E，Caspase-3在SDI中濃度組中的表達(dá)；F，Caspase-3在SDI高濃度組中的表達(dá)。Fig. 2 Mouse ovary Ki-67 and Caspase-3 expression (×400)(n=6)Note: A, Ki-67 expression in the control group; B, expression of Ki-67 in SDI medium concentration group; C, expression of Ki-67 in SDI high concentration group; D, expression of Caspase-3 in the control group; E, expression of Caspase-3 in SDI medium concentration group; F, expression of Caspase - 3 in SDI high concentration group.

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠卵巢組織Ki-67及Caspase-3 mRNA表達(dá)注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.01。Fig. 3 The mRNA expression of Ki-67 and Caspase-3 in mouse ovarian tissues were detected by Real time PCR (±s, n=3)Note: * compared with the control group, P<0.05; # compared with the control group, P<0.01.

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠卵巢組織Ki-67及Caspase-3 mRNA表達(dá)

如圖3所示，與對(duì)照組相比，隨著SDI劑量的增加，小鼠卵巢組織Ki67表達(dá)逐漸減少，*P<0.05(與對(duì)照組比較)，#P<0.01(與低劑量組比較)。然而，隨著SDI劑量的增加，小鼠卵巢組織Caspase-3的表達(dá)逐漸增加，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 Western Blotting檢測(cè)小鼠卵巢組織Ki-67及Caspase-3蛋白表達(dá)

如圖4所示，與對(duì)照組比較，中劑量及高劑量SDI作用后，Ki-67蛋白水平顯著降低，*P<0.05，#P<0.01。然而，中劑量及高劑量SDI作用后，Caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論(Discussion)

卵巢顆粒細(xì)胞是體內(nèi)產(chǎn)生合成雌激素的重要細(xì)胞。雌性動(dòng)物體內(nèi)的雌激素主要由卵巢顆粒細(xì)胞將卵泡膜細(xì)胞合成的睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌二醇及雌酮[6]。SDI是否對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生了不良影響目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究在SDI染毒后，光鏡下觀察卵巢組織顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。與對(duì)照組相比，SDI低劑量組卵巢體積正常，卵巢皮質(zhì)各級(jí)卵泡基本正常，顆粒細(xì)胞無明顯變化。中劑量組小鼠的卵巢體縮小，皮質(zhì)萎縮，各級(jí)卵泡均可見，但高劑量組部分區(qū)域可見纖維組織增生，有間質(zhì)小血管擴(kuò)張充血，嚴(yán)重者卵巢皮質(zhì)明顯變薄，結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)纖維化，卵泡數(shù)量明顯減少，閉鎖卵泡增多，成熟卵泡幾乎不可見，黃體細(xì)胞明顯增大變空，部分顆粒細(xì)胞水變性更明顯。由此可見，卵巢的病理變化的程度與SDI有一定的劑量相關(guān)性。

圖4 Western Blotting檢測(cè)小鼠卵巢組織Ki-67及Caspase-3的表達(dá)注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.01。Fig. 4 The protein expression of Ki-67 and Caspase-3 in mouse ovarian tissues were detected by Western Blotting (±s, n=3)Note: compared with the control group, *P<0.05, # P<0.01.

Ki-67是一種能識(shí)別存在于增殖細(xì)胞核基質(zhì)內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，能反映組織細(xì)胞的增殖活性。作為增殖相關(guān)的核抗原，Ki-67在細(xì)胞活動(dòng)期(G1, S, G2和M)表達(dá)，但在細(xì)胞靜息期(G0)缺失[7]。Ki-67水平在G1期和S期水平較低，但在有絲分裂的早期，Ki-67水平迅速升高[8]，在有絲分裂的晚期表達(dá)迅速下降，Ki-67的合成和降解在細(xì)胞周期的任何時(shí)候都被精確調(diào)控。因此它是重要的細(xì)胞增殖標(biāo)志[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組Ki-67總陽性細(xì)胞率明顯降低。

目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機(jī)制，卵巢細(xì)胞凋亡的過程由多種基因參與完成，包括Bcl-2/Bax、Caspase-3、Fas/Fasl、C-myc等[10-11]。在參與凋亡調(diào)控的眾多因子中,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)起重要作用，其中Caspase-3是推動(dòng)細(xì)胞凋亡的主要因素之一[10-11]。文獻(xiàn)報(bào)道也表明，卵巢閉鎖及黃體萎縮退化時(shí)發(fā)生細(xì)胞凋亡，特別是顆粒細(xì)胞[11]。因此，觀察小鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3表達(dá)變化，推測(cè)蘇丹紅I可能對(duì)性腺細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。Caspase-3通常以非活化的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，其活化通常有2條途徑[11-12]：一是經(jīng)細(xì)胞膜表面受體如Fas、TNFR1等死亡受體介導(dǎo)的活化，外在通路的激活依賴于跨膜死亡受體的配體，屬于腫瘤壞死因子超家族，配體涉及到炎癥和細(xì)胞死亡程序，如TNF-α、CD95L以及TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)；另一條途徑是內(nèi)在的線粒體通路，即死亡刺激因子如缺氧、活性氧(ROS)以及生長因子缺乏等作用下，線粒體釋放細(xì)胞色素C及活化的Caspase-3，通過裂解一系列底物而引起細(xì)胞凋亡[13]。卵巢顆粒細(xì)胞與卵巢周期卵泡發(fā)育成熟關(guān)系密切，它的凋亡是誘導(dǎo)卵泡閉鎖的重要因素[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDI染毒后卵巢組織顆粒細(xì)胞Caspase-3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SDI染毒后顆粒細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)增加，且Caspase-3表達(dá)呈劑量依賴性，但Ki-67表達(dá)受到抑制。

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◆

Injury and Expression of Caspase-3 and Ki-67 in Ovary of Mice Exposed to Sudan I

Wei Ming1,*, Gan Lu2, Long Weihong2, Hou Jin1, Deng Yating1, Chen Yulong3, Chen Lihong2

1. Department of Pharmacology and Toxicology of Xi'an Medical University, Xi’an 710021, China2. Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi’an 710068, China3. Institute of Basic and Translational Medicine, Xi'an Medical University, Xi'an 710021, China

31 October 2016 accepted 20 December 2016

Sudan is a synthetic azo dye and can cause tumors in multiple organs including liver and urinary system, but the research in reproductive system toxicity is rare. The effect of Sudan I on the expression of Caspase-3 and Ki-67 in the ovarian tissue of mice was studied by gastric gavage. The 24 Kunming mice were randomly divided into 4 groups: control group, low dose (60 mg·kg-1), medium dose (120 mg·kg-1) and high dose (240 mg·kg-1) group. Each group contained 6 mice. After gastric gavage for 4 weeks, the pathological changes were observed by HE staining. The expression of Caspase-3 and Ki-67 in ovary was detected by immunohistochemistry and the mRNA expression and protein expression of Ki-67 and Caspase-3 in mouse ovarian tissues were detected by real time PCR and western blotting. Compared with the control group, the rate of Ki-67 positive cells was significantly lower in high concentration group (P<0.05). The rate of Caspase-3 positive cells was significantly increased (P<0.05) in high concentration group and the results of PCR and western blotting were consistent with the immunohistochemical results. The Caspase-3 expression of ovarian granulosa cell was increased after SDI exposure, but the Ki-67 expression was inhibited.

Sudan I; ovary; Caspase-3; Ki-67

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016JM8046，2014JQ2-8055)；西安醫(yī)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科資助項(xiàng)目(2015097)；陜西省衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目(2014A)；陜西省教育廳重點(diǎn)科研攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(16JS096)；西安醫(yī)學(xué)院2016博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2016DOC22)

魏明(1978-)，男，博士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)，E-mail:weiming@xiyi.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20161031001

2016-10-31 錄用日期：2016-12-20

1673-5897(2017)2-088-06

X171.5

A

魏明(1978-)，男，博士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)。

魏明，甘露，龍衛(wèi)紅, 等. 蘇丹紅I對(duì)小鼠卵巢的損傷作用及對(duì)Caspase-3和Ki-67表達(dá)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 88-93

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