孫雪東 嚴(yán)一核 劉芳 褚韋韋 張亦婷 應(yīng)利君

血必凈聯(lián)合法舒地爾對(duì)膿毒癥急性腎損傷后腎小管細(xì)胞凋亡的影響

孫雪東 嚴(yán)一核 劉芳 褚韋韋 張亦婷 應(yīng)利君

目的 探討早期應(yīng)用血必凈聯(lián)合法舒地爾對(duì)膿毒癥急性腎損傷后腎小管細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為分假手術(shù)組、膿毒癥組、血必凈組、法舒地爾組和聯(lián)合用藥組，每組12只。以盲腸結(jié)扎穿孔法制造膿毒癥模型，假手術(shù)組麻醉后開腹翻動(dòng)腸道，隨即關(guān)腹；膿毒癥組按4ml/kg尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液；血必凈組按4ml/kg注射血必凈；法舒地爾組按20mg/kg注射鹽酸法舒地爾；聯(lián)合用藥組予等劑量血必凈和法舒地爾注射。在造模后6、24h再將每組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)大鼠的腎功能和炎癥指標(biāo)，觀察腎小管病理改變、測(cè)定腎小管損傷評(píng)分，采用TUNEL法觀察腎小管凋亡細(xì)胞，并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。用免疫印跡法測(cè)定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表達(dá)的變化。結(jié)果 （1）造模后24h時(shí)與膿毒癥組相比，各用藥組腎功能均能明顯改善（P＜0.05），在抑制TNF-α、IL-6表達(dá)上聯(lián)合用藥組優(yōu)于兩單藥組（均P＜0.05）。（2）造模后24h時(shí)聯(lián)合用藥組與兩單藥組比較，腎小管損傷評(píng)分和AI值明顯降低（均P＜0.05）。（3）造模后24h時(shí)聯(lián)合用藥組與兩單藥組比較，更能抑制MYPT-1的磷酸化，促使caspase-3表達(dá)下降（均P＜0.05）。結(jié)論 膿毒癥早期血必凈聯(lián)合法舒地爾可以通過Rho/ROCK信號(hào)通路抑制凋亡蛋白的表達(dá)，減少腎小管細(xì)胞在膿毒癥進(jìn)程中的凋亡，發(fā)揮協(xié)同作用減輕膿毒癥導(dǎo)致的急性腎損傷。

血必凈 法舒地爾 膿毒癥急性腎損傷凋亡 Rho激酶

嚴(yán)重膿毒癥往往引起多臟器功能不全，患者病死率高達(dá)25%～80%[1]，在ICU中是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。近年來，細(xì)胞凋亡通路的激活被認(rèn)為是導(dǎo)致膿毒癥急性腎損傷的重要原因，Rho被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的分子啟動(dòng)因子[1-2]；阻斷該信號(hào)通路可以減少炎性介質(zhì)的生成，減輕炎性反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡。而血必凈注射液可以通過抑制膿毒癥時(shí)失控的炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞的凋亡和組織的氧化損傷，被廣泛應(yīng)用于膿毒癥的臨床治療[2]；法舒地爾是目前唯一應(yīng)用于臨床的Rho酶抑制劑，能改善微循環(huán)，可擴(kuò)張入球小動(dòng)脈和收縮出球小動(dòng)脈，使腎小球?yàn)V過率增加，同時(shí)通過Rho/ROCK通路抑制細(xì)胞的凋亡，改善內(nèi)毒素所致的急性腎損傷后腎功能和腎臟病理改變，減輕炎性反應(yīng)[3]。由于臨床上少有兩藥聯(lián)用的報(bào)道，因此筆者將血必凈聯(lián)合法舒地爾應(yīng)用于膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，觀察兩者在Rho/ROCK信號(hào)通路上對(duì)膿毒癥急性腎損傷的作用和對(duì)腎小管細(xì)胞凋亡的影響，以及兩藥聯(lián)用可否起到協(xié)同作用，并探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級(jí)SD大鼠60只，體重180～220g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供和飼養(yǎng)；合格證號(hào): SYXK（浙）2010-0126。實(shí)驗(yàn)造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。血必凈注射液（天津紅日公司，10ml/支），鹽酸法舒地爾射液（天津紅日公司，30mg/支）。ELISA法試劑盒（上海生化公司）。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）試劑盒、DAB試劑盒（上海生化公司），免疫組化試劑盒：ROCK-1（英國(guó)Abcam公司）、caspase-3（美國(guó)Cell Signal公司）、p-MYPT-1（英國(guó)Abcam公司）、total-MYPT-1（英國(guó)Abcam公司）、β-actin（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 動(dòng)物模型的制作和分組 參照文獻(xiàn)[5]以盲腸結(jié)扎穿孔法（cecalligation and puncture,CLP）制造膿毒癥模型，以隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、膿毒癥組、血必凈組、法舒地爾組和聯(lián)合用藥組，每組12只；對(duì)各組分別以造模后6、24h作為觀察點(diǎn)再以隨機(jī)數(shù)字表法分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。CLP后0.5h大鼠出現(xiàn)精神軟弱、活動(dòng)減少、毛色雜亂無光澤、呼吸稍促、喜飲水、解稀便，說明動(dòng)物模型制作成功[5-6]。假手術(shù)組麻醉后開腹翻動(dòng)腸道，隨即關(guān)腹；膿毒癥組CLP后0.5h尾靜脈按4ml/ kg注射0.9%氯化鈉注射液；血必凈組CLP后0.5h尾靜脈按4ml/kg注射血必凈；法舒地爾組CLP后0.5h尾靜脈按20mg/kg注射鹽酸法舒地爾；聯(lián)合用藥組予等劑量血必凈和法舒地爾尾靜脈注射。首次給藥后每12h重復(fù)給藥1次。所有大鼠在手術(shù)后均常規(guī)予以注射30ml/kg 的0.9%氯化鈉注射液復(fù)蘇。

1.3 生化和炎癥指標(biāo)的檢測(cè) 在造模后6、24h用戊巴比妥50mg/kg經(jīng)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，剖腹暴露腎臟，并經(jīng)腹主動(dòng)脈采血、切取腎臟標(biāo)本。用全自動(dòng)生化儀（日本日立7600）檢測(cè)血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。用ELISA法檢測(cè)血液中TNF-α、IL-6水平，按說明書操作。

1.4 病理組織學(xué)檢測(cè) 對(duì)腎臟組織常規(guī)用10%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色。在光鏡下觀察腎組織的病例變化，進(jìn)行腎臟腎小管損傷評(píng)分的評(píng)定，作半定量分析。腎損傷定義為：腎小管退化、空泡變性，管型形成，小管壞死和炎癥浸潤(rùn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常組織；1分，單細(xì)胞、點(diǎn)灶性壞死；2分，腎小管受損面積≤25%；3分，腎小管受損面積26%～50%；4分，腎小管受損面積51%～75%；腎小管受損面積≥76%[5]。

1.5 TUNEL法測(cè)定腎小管凋亡細(xì)胞 采用TUNEL試劑盒并按試劑盒的說明進(jìn)行操作來檢測(cè)凋亡的DNA碎片：將石蠟切片脫蠟脫水，用蛋白酶K孵育，微波修復(fù)抗原，滴加TUNEL反應(yīng)液，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)抗熒光素抗體工作液，用DAB顯色劑呈色；最后脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細(xì)胞核呈棕黃色，即為陽性細(xì)胞。每視野內(nèi)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率即為凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），即AI＝陽性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)× 100%。采用Image-Pro Plus-6.0軟件對(duì)圖像的AI進(jìn)行盲法分析。

1.6 免疫印跡法測(cè)定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達(dá) 取新鮮腎臟髓質(zhì)40mg在400μl的RIPA裂解液（50 mMTris-HCl pH 7.4，150 mMNaCl，1mM PMSF，1%NP-40）中進(jìn)行勻漿，然后在4℃下進(jìn)行12 000r/min離心15min×2，除去未破裂的細(xì)胞、細(xì)胞核和線粒體。細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到新的試管，測(cè)定總蛋白濃度。所有細(xì)胞上清液調(diào)整到相同的蛋白濃度，并在SDS緩沖液65℃中加溫15min，保存于-20℃?zhèn)溆?。進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用一抗ROCK-1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、p-MYPT-1（1∶1 000）、total-MYPT-1（1∶500）、β-actin（1∶2 000）孵育過夜，最后用二抗（兔抗鼠，1∶500）孵育2h，ECL試劑顯色，JY-Clear ECL型化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像。ROCK-1、caspase-3的表達(dá)用各自蛋白的表達(dá)與內(nèi)參β-actin比值表示，MYPT-1的表達(dá)用p-MYPT-1/total-MYPT-1比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎功能變化和炎癥指標(biāo)的比較各組大鼠造模6h后Cr、BUN水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；24h后各組大鼠Cr、BUN水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且24h后膿毒癥組Cr水平明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），各用藥組Cr水平明顯低于膿毒癥組（P＜0.05），但3組用藥組間的Cr水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；聯(lián)合用藥組BUN水平均低于其他單藥組（P＜0.05），而兩單藥組與膿毒癥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組大鼠6、24h后TNF-α、IL-6水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；各用藥組6、24h后TNF-α、IL-6水平均低于膿毒癥組（均P＜0.05），聯(lián)合用藥組低于兩單藥組（P＜0.05），但兩單藥組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎功能變化和炎癥指標(biāo)的比較

2.2 各組大鼠腎組織病理改變和腎小管損傷評(píng)分的比較 假手術(shù)組腎小管病理基本正常；膿毒癥組見明顯腎小管壞死，透明管型并伴有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)；血必凈組、法舒地爾組腎小管空泡變性減少，單核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；聯(lián)合用藥組局部腎小管空泡變，詳見圖1（見插頁）。各組大鼠造模6、24h后腎小管損傷評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；膿毒癥組造模6h后腎小管損傷評(píng)分高于假手術(shù)組（P＜0.05），聯(lián)合用藥組評(píng)分明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）；其余各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。24h時(shí)膿毒癥組和各用藥組評(píng)分均高于假手術(shù)組（均P＜0.05），兩單藥組與膿毒癥組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但聯(lián)合用藥組明顯低于膿毒癥組（P＜0.05）,詳見表2。

2.3 TUNEL法檢測(cè)腎小管凋亡細(xì)胞 結(jié)果顯示，假手術(shù)組無凋亡細(xì)胞；膿毒癥組顯示簇狀、隊(duì)列狀排列的凋亡細(xì)胞；血必凈組和法舒地爾見分散分布的凋亡細(xì)胞，聯(lián)合用藥組見少量分散隊(duì)列狀凋亡細(xì)胞，提示膿毒癥導(dǎo)致腎小管細(xì)胞的凋亡，詳見圖2（見插頁）。各組大鼠造模6h后AI比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），24h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各用藥組造模24h后AI值均明顯低于膿毒癥組（均P＜0.05），聯(lián)合用藥組均低于兩單藥組（均P＜0.05），兩單藥組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。

表2 各組各時(shí)點(diǎn)腎小管損傷評(píng)分的比較（分）

表3 各組大鼠腎小管凋亡情況的比較（%）

2.4 各組大鼠ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表達(dá)的比較 各組大鼠造模6h后ROCK-1、MYPT-1比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而capase-3在各組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；造模24h后各組ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。造模6h后capase-3表達(dá)在各用藥組低于膿毒癥組（P＜0.05），聯(lián)合用藥組低于兩單藥組（P＜0.05）。造模24h后ROCK-1在各用藥組的表達(dá)高于膿毒癥組（P＜0.05），但各用藥組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；MYPT-1和caspase-3在聯(lián)合用藥組的表達(dá)低于膿毒癥組，且低于兩單藥組（P＜0.05），見表4、圖3。

3 討論

膿毒癥是感染后導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重膿毒癥可導(dǎo)致多器官功能障。根據(jù)臨床治療和文獻(xiàn)報(bào)道，膿毒癥發(fā)生6h后可檢測(cè)到血清中多種炎癥介質(zhì)增高，如果6h內(nèi)有效的集束化治療可以明顯改善膿毒癥預(yù)后，24h后臨床指標(biāo)明顯改善，大大增加患者的生存率[4]；因此本研究選用造模后6、24h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)予以觀察。研究表明，近半數(shù)的膿毒癥患者在病程中出現(xiàn)膿毒性急性腎損傷（SI-AKI）使患者病死率成倍增加甚至高達(dá)75%[1-2]。目前細(xì)胞凋亡通路的激活被認(rèn)為是導(dǎo)致早期急性膿毒性腎損傷的重要原因[5]，本研究從中藥血必凈聯(lián)合法舒地爾入手，從Rho/ ROCK信號(hào)通路來探討對(duì)SI-AKI的腎小管細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

表4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達(dá)

圖3 各組大鼠造模24h后ROCK-1、MYPT-1和caspase-3的表達(dá)

凋亡是指程序性死亡，是一個(gè)清除壞死和異常細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。Rho相關(guān)激酶ROCK是絲氨酸/蘇氨酸相關(guān)的異構(gòu)體，被認(rèn)為是Rho蛋白的效應(yīng)蛋白，在細(xì)胞凋亡的起始階段發(fā)揮重要作用[6-7]。ROCK蛋白廣泛存在與哺乳動(dòng)物內(nèi)，包括ROCK-1和ROCK-2；ROCK-1主要存在與肝、腎、睪丸等非神經(jīng)組織[8]。ROCK通過磷酸化下游肌球蛋白結(jié)合亞基磷酸酶靶蛋-1(MYPT-1)從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞調(diào)節(jié)功能[9]。同時(shí)，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡階段體內(nèi)caspase-3可以使ROCK-1發(fā)生構(gòu)象性改變，導(dǎo)致ROCK-1處于持續(xù)性活化狀態(tài)[10-11]。抑制capase-3、MYPT-1的表達(dá)可以減少效應(yīng)蛋白R(shí)OCK-1的表達(dá)，從而減少腎小管細(xì)胞的凋亡，改善腎臟灌注和腎功能有重要意義[12]。

血必凈是在“菌、毒、炎”并治的理論指導(dǎo)下研制而成的水性注射液，能抑制多種細(xì)胞炎癥因子；主要成分有川芎、赤芍、丹參、紅花等提取物，具有行氣活血、清熱涼血、解毒止痛的功效，能擴(kuò)張外周微血管，具有改善組織灌注與微循環(huán)，能抑制過度的炎性介質(zhì)釋放[13-14]。而法舒地爾是目前唯一應(yīng)用于臨床的ROCK抑制劑，有抑制鈣敏化效應(yīng)，利于血管平滑肌的舒張，可擴(kuò)張入球小動(dòng)脈和收縮出球小動(dòng)脈，使腎小球?yàn)V過率增加，同時(shí)降低炎性介質(zhì)的形成，能減輕炎性反應(yīng)，減少氧自由基的生成[15-16]。同時(shí)國(guó)內(nèi)學(xué)者瞿星光等[4]通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為法舒地爾可以改善內(nèi)毒素所致的急性腎損傷后腎功能和病理損傷減輕炎性反應(yīng)；通過直接抑制ROCK-l活性，并下調(diào)GRP78、CHOP等炎癥蛋白，抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激所致的損傷[3，15]。本研究免疫印跡法測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：膿毒癥發(fā)生后MYPT-1磷酸化增加、caspase-3表達(dá)不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致ROCK-1處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而產(chǎn)生一系列的病理性損害；血必凈和法舒地爾應(yīng)用24h時(shí)均可以減少M(fèi)YPT-1的磷酸化，阻止ROCK-1在膿毒癥中的過度表達(dá)，同時(shí)可以使caspase-3表達(dá)降低。從炎癥因子角度出發(fā)，兩藥聯(lián)用在膿毒癥早期6h時(shí)，即可抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)；從生化和組織學(xué)上來看，在膿毒癥發(fā)生后各用藥組24h時(shí)均能明顯改善腎功能的惡化，減輕腎臟組織學(xué)的形態(tài)學(xué)改變；從TUNEL免疫染色來看能夠明顯減少腎小管細(xì)胞的凋亡。但兩藥聯(lián)用對(duì)抑制caspase-3、MYPT-1的表達(dá)和降低AI值來看可協(xié)同發(fā)揮作用，更好地抑制腎小管細(xì)胞的凋亡。這些證據(jù)表明血必凈能夠通過Rho激酶通路抗腎小管細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，筆者認(rèn)為Rho/ROCK通路與膿毒癥性急性腎損傷密切相關(guān)，早期聯(lián)合應(yīng)用血必凈和法舒地爾可以改善膿毒癥導(dǎo)致急性腎損傷的病理學(xué)改變，減少腎小管細(xì)胞在膿毒癥進(jìn)程中的凋亡。單味中藥往往療效甚微，和法舒地爾聯(lián)用充分發(fā)揮了中西醫(yī)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)[17-18]，為兩藥聯(lián)用治療SI-AKI提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；但對(duì)于臨床的應(yīng)用仍然有待進(jìn)一步的深入研究。

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Inhibitory effects of Xuebijing injection combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injury of rats

SUN Xuedong,YAN Yihe,LIU Fang,et al.Department of Critical Care Medicine,Shaoxing People's Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect of Xuebijing combined with fasudil on tubular apoptosis in sepsis-induced acute kidney injure(SI-AKI)of rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into five groups:sham group,sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group with 12 rats in each group.Sham operation was performed in rats of sham group;SI-AKI were induced by cecal ligation and puncture(CLP)surgery in other 4 groups.0.9%sodium chloride at 4ml/kg,Xuebijing at 4ml/kg,fasudil at 20mg/kg and Xuebijing with fasudil were injected via caudal vein in sepsis group,Xuebijing group,fasudil group and combination group,respectively.Six rats were sacrificed in each group at 6h and 24h after treatment, respectively.Renal function parameters,inflammation factors,pathological changes of tubules,renal tubular injury score were measured.The apoptosis of renal tubular cells was determined by TUNEL method,apoptotic indices (AI)were calculated.The expressions of ROCK-1,MYPT-1 and caspase-3 were detected by Western blot. Results At 24h after treatment,the renal function in 3 treatment groups was significantly improved compared to sepsis group (P＜0.05).The TNF-α,IL-6 levels in combination group were lower than those in other two treatment groups(all P＜0.05).The tubular damage scores and AI values in combination group were more attenuated compared to other two treatment groups(all P＜0.05).The phosphorylation of MYPT-1 was more markedly inhibited and the caspase-3 expression was decreased in combination group compared to other two treatment groups(all P＜0.05). Conclusion Early application of Xuebijing combined with fasudil can alleviate renal dysfunction and pathological changes,reduce the tubular cell apoptosis in SI-AKI rats,in which the Rho-kinase signaling pathway may be involved.

Xuebijing FasudilSepsis acute kidney injury apoptosis Rho-kinase

2016-09-19）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

紹興市科技計(jì)劃（2014B70066）

312000 紹興市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（孫雪東、嚴(yán)一核、褚韋韋、張亦婷、應(yīng)利君），病理科（劉芳）

孫雪東，E-mail：drsxd@tom.com