戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱發(fā)明

獻(xiàn)血人群中HCV感染與HLA-II類基因的相關(guān)性研究

戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱發(fā)明

目的 人類白細(xì)胞抗原（HLA）在機(jī)體抗病毒免疫中起重要作用，探討獻(xiàn)血人群中丙型肝炎病毒（HCV）感染與HLA-II類基因的相關(guān)性。方法 選擇2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心獻(xiàn)血的人員中HCVRNA陽(yáng)性的樣本45例，同時(shí)以健康人群為對(duì)照，其中HLA-DRB1位點(diǎn)對(duì)照樣本8 333例，HLA-DRB1位點(diǎn)對(duì)照樣本72例，用PCR-SBT方法測(cè)定獻(xiàn)血者HLA-II類基因中DRB1和DQB1等位基因情況。結(jié)果 HLA-DRB1基因的DRB1*01:02（P=0.0394，OR=23.4，95%CI=2.89～189.1），DRB1*13:01（P=0.0095，OR=5.60，95%CI：1.74～18.00）；HLA-DQB1基因的DQB1*03:03（P=0.0402，OR=0.45，95%CI：0.21～0.94），DQB1*06:01（P=0.0456，OR=2.47，95%CI：1.05～5.83），這些基因位點(diǎn)的多態(tài)性在HCVRNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者中的頻率與健康對(duì)照人群比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 在獻(xiàn)血人群中HCV感染與HLA-II類基因中部分多態(tài)性位點(diǎn)有相關(guān)性。

獻(xiàn)血人群 HCV HLA-II類基因

人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因定位于第6號(hào)染色體短臂21.3區(qū)域，全長(zhǎng)為3 600kb，是目前所知最復(fù)雜的多態(tài)性遺傳系統(tǒng)，具有高度個(gè)體特性。HLA基因編碼的分子參與抗原的加工與遞呈、細(xì)胞間識(shí)別、抗病毒免疫調(diào)節(jié)、免疫殺傷等過(guò)程，具有重要的免疫功能。國(guó)外研究顯示[1-4]個(gè)體HLA基因型與HCV感染、病毒復(fù)制、對(duì)藥物反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程存在一定的相關(guān)性。由于HLA基因呈現(xiàn)高度遺傳多態(tài)性，不同人群不同地區(qū)存在明顯的不同，而且HCV感染存在著很大的種族和地域上的差異，因此國(guó)外的研究數(shù)據(jù)并不一定適合我國(guó)人群。筆者對(duì)浙江獻(xiàn)血人群中HCV感染與HLA-II類基因相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心獻(xiàn)血的人員HCV RNA陽(yáng)性樣本45例，并隨機(jī)選取HCV RNA陰性的健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中HLA-DRB1對(duì)照組8 333例，HLA-DQB1對(duì)照組72例。獻(xiàn)血者的選擇按照《獻(xiàn)血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)》[5-6]。

1.2 試劑與儀器 美國(guó)Theremo electron corporation 的Forma classⅡA2生物安全柜；美國(guó)羅氏公司全自動(dòng)核酸抽提系統(tǒng)MagNA Pure LC 2.0；美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司 NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ND2000）；美國(guó)ABI3730 DNA測(cè)序儀；ABI PCR擴(kuò)增儀。抽提試劑：羅氏公司MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（產(chǎn)品編號(hào)：03310515001）；擴(kuò)增試劑：invitrogen Secore DRB1/DQB1Amp Swquencing kit；測(cè)序試劑：invitrogen Secore DRB1/DQB1 locus sequencing Kit。

1.3 基因組DNA的提取 吸取全血樣本100μl。使用MagNA LC 2.0全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)，應(yīng)用配套MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume自動(dòng)抽提試劑盒，嚴(yán)格按儀器使用說(shuō)明書操作。抽提后的DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，純度要求≥1.6，并用不含RNA酶的無(wú)菌水調(diào)整濃度至15～40ng/μl。

1.4 HLA-DRB1和DQB1基因片段的擴(kuò)增及測(cè)序

1.4.1 HLA-DRB1和DQB1基因片段的擴(kuò)增 擴(kuò)增引物為試劑盒內(nèi)置引物，試劑按試劑盒要求。熱循環(huán)條件為：預(yù)變性2步，95℃、10min，96℃、20s；PCR反應(yīng)2步，36個(gè)循環(huán)：60℃、30s，72℃、3min。擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4.2 酶切反應(yīng) 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入3μl ExoSAPIT，混勻離心后經(jīng)過(guò)37℃，25min，80℃，15min的酶切反應(yīng)后去除反應(yīng)孔中多余的PCR引物和底物dNTPs，酶切后每孔加入2倍體積的無(wú)菌去離子水稀釋。

1.4.3 測(cè)序反應(yīng) 在每個(gè)反應(yīng)管/孔中分別加入8μl sequencing mix和2μl Exo SAP-IT處理過(guò)的PCR產(chǎn)物，離心混勻。運(yùn)行熱循環(huán)程序：預(yù)變性：96℃、20s；PCR反應(yīng)2步，25個(gè)循環(huán)，50℃、30s，60℃、2min。

1.4.4 測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化 將測(cè)序產(chǎn)物用40μl乙醇沉淀，在每個(gè)測(cè)序反應(yīng)孔中加入2μl NaAc/EDTA緩沖液。板震蕩2min，確保溶液混合均勻，離心3 000×g，30min后。將反應(yīng)孔倒扣于面巾紙上離心500×g 1min，去除孔內(nèi)液體。在每個(gè)測(cè)序反應(yīng)孔中加入100μl 80%的乙醇溶液。離心3 000×g，5min。將反應(yīng)孔倒扣于面巾紙上500×g離心1min，去除孔內(nèi)液體，避光室溫干燥20min。

1.4.5 測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物變性 在每個(gè)測(cè)序反應(yīng)管中，加入15μl HiDi Formamide 0.3 mM EDTA水溶液，蓋白色貼膜，震蕩混勻，低速離心。置于PCR儀器上95℃變性2min，反應(yīng)結(jié)束立刻置于冰上3min待溫度降下后，上毛細(xì)管測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定HLA等位基因的位點(diǎn)。與本試劑盒相匹配的分析軟件是Assign SBT（Conexio Genomics，Western Australia）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性人群與對(duì)照人群HLA頻率分析應(yīng)用ARLEQUIN Ver 3.5軟件（http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3）。應(yīng)用 Graphpad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同人群HLA基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性組與正常對(duì)照組HLA多態(tài)性危險(xiǎn)因素暴露情況采用相對(duì)危險(xiǎn)度（odd ratio，OR）。

2 結(jié)果

2.1 獻(xiàn)血者中HCV RNA陽(yáng)性人群HLA-Ⅱ基因頻率分布情況 HCV RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血者樣本HLA-DRB1和HLA-DQB1基因頻率分布見表1～2。

表1 HLA-DQB1在HCV RNA陽(yáng)性獻(xiàn)血中的分布頻率

表2 LA-DRB1在HCV RAN陽(yáng)性獻(xiàn)血中的分布頻率

2.2 正常對(duì)照組HLA-Ⅱ基因頻率分布情況 正常對(duì)照組中HLA-DRB1和HLA-DQB1基因頻率分布數(shù)據(jù)分布見表3～4。

2.3 獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性組與正常對(duì)照組HLA基因頻率及特定位點(diǎn)多態(tài)性的分析 獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性組及正常對(duì)照組HLA等位基因頻率分布詳見表5～6。HLA-DRB1基因的 DRB1*01:02、DRB1*13:01，HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01，這些基因位點(diǎn)的多態(tài)性在HCV確認(rèn)感染獻(xiàn)血者與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除HLA-DQB1*03:03為保護(hù)性基因外，上述多態(tài)性位點(diǎn)均為易感基因。

表3 正常對(duì)照組HLA-DRB1的分布頻率

表4 正常對(duì)照組HLA-DQB1的分布頻率

表5 獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性組與正常對(duì)照組HLA-DRB1的頻率分析

3 討論

HCV病毒感染并引發(fā)肝臟損傷的機(jī)制目前尚未完全明確，但有文獻(xiàn)報(bào)道宿主的HLA遺傳多態(tài)性與HCV感染、病毒的復(fù)制以及肝細(xì)胞損傷方面可能存在較大的作用。HLA基因編碼的分子參與抗原的加工與遞呈、細(xì)胞間識(shí)別、抗病毒免疫調(diào)節(jié)、免疫殺傷等過(guò)程，具有重要的免疫功能。Cangussu等[7]報(bào)道了巴西人中HLA-Ⅱ類等位基因DRB1*11和DQB1*03位點(diǎn)與慢性HCV感染的保護(hù)有關(guān)，它們可能通過(guò)選擇病毒表位遞呈給CD4+T細(xì)胞，從而影響抗病毒的免疫應(yīng)答效應(yīng)。Anuradha等[8]報(bào)道了印度西部人群中HLA-Ⅰ類等位基因A*03、A*32、B*15、B*55、CW*16、CW*18以及HLA-Ⅱ類等位基因DRB1*03、DQB1*03與HCV感染呈現(xiàn)相關(guān)性。上述研究顯示HLA基因型與HCV的感染存在一定的相關(guān)性，但是目前有關(guān)浙江人群HCV感染與個(gè)體HLA之間的關(guān)系尚缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)。

表6 獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性組與正常對(duì)照組HLA-DQB1的頻率分析

本實(shí)驗(yàn)室采用PCR-SBT的方法分析了獻(xiàn)血者HCV RNA陽(yáng)性及正常對(duì)照人群的HLA-Ⅱ類基因的頻率分布，發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1基因的DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01基因頻率與正常對(duì)照人群比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。根據(jù)OR值情況發(fā)現(xiàn)在這些有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的HLA基因中屬于HCV易感基因的為HLA-DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1*06:01，保護(hù)性基因?yàn)镠LA-DQB1*03: 03。既往研究結(jié)果中很多為低分辨數(shù)據(jù)，而本實(shí)驗(yàn)室得到的HLA頻率數(shù)據(jù)均為高分辨數(shù)據(jù)，有一些數(shù)據(jù)存在差異，這些差異數(shù)據(jù)更能反應(yīng)本地區(qū)特點(diǎn)，結(jié)合HCV生物學(xué)特點(diǎn)數(shù)據(jù)更有利于闡明HLA在獻(xiàn)血人群HCV感染中的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)保障血液安全，探索HLA功能以及研究其與疾病的相關(guān)性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有重要的臨床意義。

[1] Kallas E,Huik K,Türk S,et al.T Cell Distribution in Relation to HIV/HBV/HCV Coinfections and Intravenous Drug Use[J].Viral Immunol,2016,29(8):464-470.

[2] Huang J,Huang K,Xu R,et al.The Associations of HLA-A*02:01 and DRB1*11:01 with Hepatitis C Virus Spontaneous Clearance Are Independent of IL28B in the Chinese Population[J].Sci Rep, 2016,11,6:31485.

[3] Waldron P R,Belitskaya-Lvy I,Chary A,et al.Genetic Variation in the IL-6 and HLA-DQB1 Genes Is Associated with Spontaneous Clearance of Hepatitis C Virus Infection[J].J Immunol Res, 2016,2016:6530436.

[4] Tseng K C,Tseng C W,Hsieh Y H,et al.Effect of human leukocyte antigen class I and II alleles on hepatitis C viral load among chronic hepatitis C patients in Southern Taiwan[J].Hum Immunol, 2013,74(8):978-982.

[5] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局《.獻(xiàn)血者健康檢查要求》(GB18467-2001). 2001.

[6] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局《.獻(xiàn)血者健康檢查要求》(GB18467-2011). 2011.

[7] Cangussu LO F,Teixeira R,Campos E F,et al.HLA Class II Alleles and Chronic Hepatitis C Virus Infection[J].Scandinavian Journal of Immunology,2011,74:282–287.

[8] Anuradha S T,Shankarkumar U,Mandeep S C,et al.Association of HLA alleles with hepatitis C infection in Maharashtra,western India[J].Indian J Med Res,2009,130:550-555.

Association of HLA-II alleles with hepatitis C virus infection in blood donors

DAI Bing,XU Gang,WANG Fang,et al.Zhejiang Provincial Blood Center,Hangzhou 310052,China

Blood donors Hepatitis C Virus HLA-II alleles

2016-01-01）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項(xiàng)目（2016KYA070、2015KYB100）

310052 杭州，浙江省血液中心，衛(wèi)生部血液安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省血液安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

朱發(fā)明，E-mail：zfm00@hotmail.com

【 Abstract】 Objective To investigate the association of HLA-II alleles with hepatitis C virus(HCV)infection in Zhejiang blood donors. Methods Forty five HCV positive cases were detected by blood nucleotide screening among blood donors in Zhejiang Provincial Blood Center from October 2011 to October 2013.HLA typing was performed with polymerase chain reaction analysis with sequence-based typing(PCR-SBT)in 45 HCVinfected blood donors;the healthy population was used for reference, including 8333 cases for HLA-DRB1 and 72 case for HLA-DQB1. Results The polymorphisms of HLA-II alleles DRB1*01:02 (OR=23.4,95%CI:2.89-189.1,P=0.0394),DRB1*13:01(OR=5.60,95%CI:1.74-18.00,P=0.0095),DQB1*03:03(OR=0.45,95%CI: 0.21-0.94,P=0.0402,),DQB1*06:01(OR=2.47,95%CI:1.05-5.83,P=0.0456)were significantly associated with HCV infection among blood donors. Conclusion Our data suggest that certain HLA-II alleles are associated with HCV infection as a host genetic factor among the Zhejiang blood donors.