陳燕珍 韓文文 李小林 趙光舉 洪廣亮 李萌芳 盧中秋

姜黃素對百草枯中毒腎臟炎癥損傷的干預研究

陳燕珍 韓文文 李小林 趙光舉 洪廣亮 李萌芳 盧中秋

目的 研究急性百草枯中毒大鼠腎損傷炎癥因子的動態(tài)變化及姜黃素的干預效果和機制。方法 將60只SD大鼠隨機分成正常對照組、姜黃素對照組、百草枯染毒組（2%百草枯溶液2ml/kg灌胃染毒）和姜黃素干預組（百草枯灌胃染毒后，每組各15只，分別在15min、24h和48h于腹腔內(nèi)注射5ml/kg姜黃素。觀察各組大鼠行為學改變。處理后第1、3、7天留取腎組織并抽取靜脈血，采用苦味酸比色法測定血清肌酐水平，脲酶法測定尿素氮水平，ELISA法分別測定IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平，Western blot檢測大鼠腎組織NF-κB表達量。觀察光鏡下各組大鼠腎組織的病理變化。結(jié)果 正常對照組、姜黃素對照組各大鼠活動靈敏，反應自如，進食正常，皮毛光滑。百草枯染毒組大鼠在染毒30min后活動增多，呈易惹狀態(tài)，6h后表現(xiàn)懶散，活動量逐漸減少，走路晃動，呼吸急促，毛發(fā)戰(zhàn)栗，不進食，3d時表現(xiàn)程度最重。姜黃素干預組以上癥狀均較百草枯染毒組為輕。與正常對照組比較，姜黃素對照組各項指標水平無明顯變化（P＞0.05）。百草枯染毒組肌酐、尿素氮水平和NF-κB表達顯著升高，肌酐、尿素氮水平在第3天達到峰值，NF-κB表達在第1、3、7天持續(xù)升高（均P＜0.05），百草枯染毒組IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平均顯著升高，IL-1β、IL-10、TNF-α水平在第3天達峰值，IL-6水平則持續(xù)升高（均P＜0.05）。與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天，肌酐、尿素氮水平和NF-κB表達顯著下降，IL-1β、IL-6、TNF-α水平亦顯著降低，IL-10水平則顯著升高（均P＜0.05）。光學顯微鏡下可見，百草枯染毒組大鼠腎組織在染毒后第3天，病理損害最嚴重，各個時間點姜黃素干預組病理損害均較百草枯染毒組有所減輕。結(jié)論姜黃素可通過下調(diào)NF-κB的表達，降低腎組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高IL-10水平來減輕百草枯所致腎損傷的炎癥反應，對急性百草枯中毒所致的腎損傷有一定的保護作用。

姜黃素 百草枯 腎臟 炎癥因子 大鼠

百草枯是一種目前廣泛使用的快速滅生性除草劑，是一種廣譜、觸殺型有機雜環(huán)類除草劑[1]。百草枯使用不當可造成急性中毒，且自服或誤服后病死率更高，在50%～70%[2]。因缺乏有效解毒劑，百草枯中毒在我國已經(jīng)成為繼有機磷農(nóng)藥中毒之后的第2位常見農(nóng)藥中毒[3]。毒物動力學研究發(fā)現(xiàn)，百草枯主要通過腎臟清除，代謝，以尿液形式排出體外。腎損傷是百草枯引起肺間質(zhì)纖維化的促進因素，因而也是影響百草枯中毒患者預后的重要因素，目前，對于急性百草枯中毒引起的腎損傷機制，并不十分清楚，但是炎癥反應已被證實在急性百草枯中毒中發(fā)揮了重要作用[4]。NF-κB是幾乎存在于所有細胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB在組織炎癥反應、氧化應激、細胞增殖、分化和凋亡等很多過程中均發(fā)揮了巨大的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)其是調(diào)控炎癥反應的核心因子[5]。目前對于急性百草枯中毒所致的腎損傷，臨床上尚缺乏有效的藥物干預。姜黃素是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗感染、抗凝、抗動脈粥樣硬化、降血脂及抑制腫瘤生長等作用[6]，并對腎臟有一定的保護作用。本研究通過建立急性百草枯中毒腎損傷大鼠模型，觀察大鼠腎組織病理學的變化，監(jiān)測大鼠腎組織肌酐、尿素氮活性、NF-κB表達及下游調(diào)控因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平和抑炎因子IL-10水平變化，探討姜黃素對急性百草枯中毒大鼠腎臟炎癥損傷的影響和可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康清潔級SD大鼠60只，2～3個月齡，雄性，體重220～250g，由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號[SCXK（浙）2010-0044]。姜黃素粉（美國Sigma公司），20%百草枯水溶液（南通先正達作物保護有限公司），血清（漿）尿肌酐測試盒、尿素氮測試盒、大鼠白介素ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），核蛋白抽提試劑盒（美國Pierce公司），BCA蛋白濃度測試盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 動物分組及處理 將60只SD大鼠隨機分為正常對照組、姜黃素對照組、百草枯染毒組和姜黃素干預組，每組15只。造模前，20%百草枯溶液用0.9%氯化鈉溶液稀釋為質(zhì)量濃度為2%的百草枯溶液，百草枯染毒組給予2ml/kg百草枯一次性灌胃染毒。姜黃素干預組經(jīng)同樣方式染毒，分別在15min、24h、48h 3個時點腹腔注射5ml/kg姜黃素（姜黃素用0.9%氯化鈉溶液稀釋成10mg/ml姜黃素溶液），正常對照組和姜黃素對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，15min、24h、48h后姜黃素對照組同樣給予姜黃素5ml/kg腹腔注射，正常對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。經(jīng)過上述處理后，觀察各組大鼠行為學的改變，如活動、反應、進食、皮毛等情況。處理后第1、3、7天，每組隨機抽取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后處死，下腔靜脈取血，靜置10min，3 500r/min離心后，取上清液，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。留取腎臟組織，PBS沖洗，分裝后立即轉(zhuǎn)入液氮，并及時轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存。取腎臟同一部位，切割成薄快（便于固定），后放入4%多聚甲醛中，用來制備腎組織病理切片。

1.3 血清肌酐及尿素氮測定 按照試劑盒說明，采用苦味酸比色法測定血清肌酐水平，脲酶法測定尿素氮水平。

1.4 腎組織IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表達水平的測定 制備10%的腎組織勻漿，BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明，用ELISA法分別測定IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表達水平。

1.5 腎組織TNF-α mRNA表達水平的測定 制備10%的腎組織勻漿，BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明，用ELISA法測定TNF-α mRNA表達水平。

1.6 腎組織NF-κB表達水平的測定 制備10%的腎組織勻漿，提取大鼠腎組織細胞核蛋白，BCA法測定腎組織核蛋白濃度，按照試劑盒說明，采用Western blot檢測大鼠腎組織細胞核內(nèi)NF-κB表達水平。

1.7 腎組織病理切片的觀察 對4%多聚甲醛固定液中保存的腎組織脫水、包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學變化 正常對照組、姜黃素對照組各大鼠表現(xiàn)活動靈敏，反應自如，進食正常，皮毛光滑。而百草枯染毒組大鼠在染毒30min后活動表現(xiàn)增多，呈易激惹狀態(tài)，6h后表現(xiàn)懶散，活動量逐漸減少，走路晃動，喜蜷縮，呼吸急促，不進食，毛發(fā)戰(zhàn)栗，第3天時表現(xiàn)程度最重，第7天時大鼠精神狀態(tài)較前有好轉(zhuǎn)，活動量有所增加，進食量基本恢復。姜黃素干預組以上癥狀均較百草枯染毒組為輕，7d時癥狀基本好轉(zhuǎn)，活動飲食增加。

2.2 各組大鼠腎組織病理學改變 正常對照組和姜黃素對照組腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，腎小管管腔正常。百草枯染毒組腎小球球囊間隙明顯增大，細胞排列紊亂，組織出現(xiàn)明顯的玻璃樣變性，并伴有管型尿，出現(xiàn)空泡樣變性，腎小管管腔上皮細胞脫落。姜黃素干預組與百草枯染毒組相比，細胞玻璃樣變性、空泡樣變性均減輕，腎小管細胞排列較整齊、緊密，腎小球病變有明顯減輕趨勢。詳見圖1（見插頁）。

2.3 各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平測定結(jié)果 姜黃素對照組與正常對照組相比，肌酐、尿素氮水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。百草枯染毒組與姜黃素對照組、正常對照組相比在第1、3、7天，肌酐、尿素氮水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與百草枯染毒組比較，姜黃素干預組肌酐、尿素氮水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮水平變化

2.4 各組大鼠腎組織血清中IL-1β、TNF-α mRNA表達水平 與正常對照組比較，姜黃素對照組IL-1β、TNF-α mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），百草枯染毒組在第1、3、7天IL-1 β、TNF-α mRNA表達水平明顯升高，第1天開始升高，3d達到峰值，隨后開始降低，但第7天仍高于正常水平，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天IL-1β、TNF-α mRNA表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠腎組織血清IL-1β、TNF-α mRNA表達水平

2.5 各組大鼠腎組織血清IL-6、IL-10mRNA表達水平的比較 與正常對照組比較，姜黃素對照組IL-6表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），百草枯染毒組在第1、3、7天IL-6水平顯著升高，IL-6水平第1天開始升高，第3天和第7天持續(xù)升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天，IL-6水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與正常對照組比較，姜黃素對照組IL-10表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），百草枯染毒組在第1、3、7天IL-10水平顯著升高，IL-10第1天開始升高，第3天達到峰值，隨后開始降低，但第7天仍高于正常水平，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天，IL-10水平均顯著且持續(xù)升高，差 異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠腎組織血清IL-6、IL-10表達水平變化

2.6 各組大鼠腎組織血清中NF-κB表達變化 正常對照組和姜黃素對照組NF-κB表達均較少，各時點比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）；與正常對照組相比，百草枯染毒組NF-κB表達在第1、3、7天明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），在第1、3天NF-κB表達量持續(xù)上調(diào)，第7天進一步升高。與百草枯染毒組比較，在第1、3、7天，姜黃素干預組腎組織NF-κB表達顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織NF-κB表達的變化（1：正常對照組，2：姜黃素對照組，3：百草枯染毒組，4：姜黃素干預組；與正常對照組比較，

3 討論

目前各項研究表明，炎癥反應是百草枯中毒導致組織器官損傷的主要機制之一：百草枯通過消化道、呼吸道或皮膚進入人體，除了百草枯本身理化作用引起的一系列中毒反應外，還包括TNF-α、IL以及IFN-γ、磷脂酶（phospholipase，PL）A2、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）等大量的炎癥因子參與了組織器官的損害，最終導致組織發(fā)生一系列病理損害[7]。彭曉東等[8]報道急性百草枯中毒后多器官功能障礙綜合征患者血清中IL-10、TNF-α在24h內(nèi)明顯升高。有實驗結(jié)果顯示，百草枯染毒兔腎組織TNF-α、IL-6均在染毒后l天表達升高，至第3天達到峰值，之后逐漸下降，說明在百草枯染毒早期就有炎癥因子的釋放，并且炎癥損害是百草枯導致腎損傷的環(huán)節(jié)之一[9]。以上說明炎癥反應可能在百草枯中毒所致器官損害中發(fā)揮了重要的作用。

百草枯主要通過腎臟代謝，以尿液形式排出體外。急性百草枯中毒后，腎損傷的發(fā)生率很高，是影響百草枯中毒患者預后的一個重要因素[10]。有研究表明，百草枯主要通過腎臟代謝，導致腎小管壞死，造成急性腎衰竭[11]。當大量攝入百草枯時，腎臟負擔過重，在百草枯中毒后的第2～3天即可出現(xiàn)血肌酐、尿素氮升高，排尿減少，造成急性腎衰竭[12]。本研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后大鼠腎臟病理變化，包括近曲小管上皮細胞腫脹、變性、壞死、間質(zhì)充血水腫，且隨著時間延長而加重，與以往研究相符。同時本次研究結(jié)果顯示：百草枯染毒組肌酐、尿素氮水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而這些指標是反應腎功能的重要指標，與前述研究相符。

NF-κB由一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)家族組成，根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成形式不同可以分為兩組：笫一組包括NF-κBl（p50）和NF-κB2（p52）。第二組包括RelA （p65）、RelB和RelC。NF-κB的活化形式是p50和RelA（p65）形成的異二聚體，位于細胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB，當靶細胞未受炎性因子刺激時同NF-κB抑制蛋白（IkB）的結(jié)合處于失活狀態(tài)；當靶細胞受到細胞因子、內(nèi)毒素、氧自由基等刺激后，NF-κB與靶基因啟動子的κB序列（GGGACTTTC）于細胞核內(nèi)結(jié)合，誘導轉(zhuǎn)錄并促進靶蛋白（如IL-lβ、IL-6、IL-8、TNF-α等）的合成，進而引起炎癥反應。由此可見，NF-κB是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)，NF-κB激活后，通過調(diào)控其下游目的基因促進炎癥因子的大量釋放，發(fā)揮促炎作用并發(fā)揮促凋亡作用，使臟器的損傷越來越重。此外NF-κB活化后可介導下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子表達增多，這些炎癥因子反過來又會激活NF-κB，形成一個NF-κB與細胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的正反饋環(huán)路，放大炎癥反應，使組織臟器損傷進一步加重[13-14]。TNF-α在炎癥反應中具有始動和關(guān)鍵的促炎免疫作用,它能增強炎癥趨化因子和其他細胞因子的釋放，并增加血管的通透性，最終導致白細胞的激活及大量炎癥因子的產(chǎn)生，且TNF-α出現(xiàn)與NF-κB呈正相關(guān)；IL-1β作用與TNF-α相似，對巨噬細胞及中性粒細胞有趨化及黏附作用，此外還具有引起發(fā)熱、上調(diào)組織因子表達、下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白表達等生物學效應，同時增加TNF-α的有害作用[15]。IL-6功能為誘導B細胞生長、分化并產(chǎn)生免疫球蛋白，形成免疫復合物，造成肺損傷。IL-10是一種細胞因子合成抑制因子，它全面抑制T細胞、NK細胞和單核巨噬細胞的活性，同時抑制這些細胞合成和釋放其他炎性細胞因子（包括IL-1β、TNF-α和IL-8等）。百草枯中毒后早期即出現(xiàn)NF-κB的激活，進而誘導炎性介質(zhì)的合成，促發(fā)炎癥反應。本研究結(jié)果表明：百草枯染毒組大鼠NF-κB表達在各個時間點顯著高于正常水平，NF-κB下游的炎性調(diào)控因子，TNF-α、IL-1β、IL-6及其蛋白表達在染毒后顯著增高，同時抑炎因子IL-10水平亦顯著升高（P＜0.05），而這些炎癥因子是反應炎癥程度的重要指標。因此可見，NF-κB是核內(nèi)炎性因子基因轉(zhuǎn)錄的中心環(huán)節(jié)，通過阻斷NF-κB的激活，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高IL-10水平可能有助于延緩百草枯中毒患者病情的發(fā)展。

隨著研究的日益深入，姜黃素已被發(fā)現(xiàn)毒性低、不良反應小，且具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、調(diào)脂、抗凝、抗肝纖維化及抗動脈粥樣硬化等的藥理活性[16-17]。在抗炎癥性損傷方面，已有的研究表明，姜黃素是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和激活蛋白1以及主要炎癥介質(zhì)如環(huán)氧合酶、脂肪氧化酶、TNF-α、IFN-γ而發(fā)揮抗炎作用[18]。同時姜黃素對肺、腦、心、肝、腎等組織的炎性損傷有著極佳的保護作用，其具體的分子機制可能是通過抑制中性粒細胞向炎性反應靶器官的聚集及隨后的活化作用有關(guān)[19]。還有研究證明姜黃素通過抑制NF-κB途徑的激活，作用于炎癥反應的多個靶分子，減少炎性因子IL-8、IL-1β等的釋放[20]。實驗研究表明姜黃素可以改善急性肺栓塞的肺部病理，可能是通過抑制肺組織NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達水平，從而破壞炎癥級聯(lián)反應有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天肌酐、尿素氮水平顯著降低與前述研究相符。與百草枯染毒組相比，姜黃素干預組在第1、3、7天，NF-κB蛋白表達顯著下降，IL-1β、IL-6、TNF-α水平亦顯著降低，抑炎因子IL-10水平則顯著升高。因此也可以推斷：姜黃素具有強大的抗炎作用同時起到對腎臟的保護作用。

綜上所述，在本實驗中，姜黃素干預組與百草枯染毒組比較，NF-κB及其下游調(diào)控因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達在各個時間點均顯著降低，IL-10水平均顯著且持續(xù)升高。腎功能指標肌酐，尿素氮顯著降低，腎組織病理也較百草枯染毒組有所改善，因此可以得出結(jié)論，在急性百草枯中毒所致的大鼠腎損傷模型中，姜黃素通過抑制NF-κB的表達，使TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降，IL-10水平升高，進而減輕腎組織的炎癥反應，從而使腎臟活性指標肌酐、尿素氮水平下降。所以，姜黃素通過減輕炎癥反應，對百草枯中毒所致腎損傷有一定的療效和作用。但是，目前對于姜黃素是通過什么樣的具體途徑和靶位對NF-κB的表達起到作用的機制尚不清楚，有待于我們的進一步研究。

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Effect of curcumin on inflammation in paraquat-induced renal injury in rats

CHEN Yanzhen,HAN Wenwen,LI Xiaolin,et al.Department of Emergency,the Yiwu Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Yiwu 322000,China

Curcumin ParaquatKidney Inflammation Rat

2016-08-03）

（本文編輯：嚴瑋雯）

項目資助：浙江省醫(yī)學創(chuàng)新學科建設(shè)計劃（11-CX26）；浙江省“十二五”浙江省高校重點學科（2012-207）

322000 溫州醫(yī)科大學附屬義烏醫(yī)院急診科（陳燕珍）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學中心（韓文文、李小林、趙光舉、洪廣亮、李萌芳、盧中秋）

盧中秋，E-mail：lzq640815@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of curcumin on inflammation in paraquat-induced kidney injury in rats. Methods Sixty male SD rats were divided into four groups randomly with 15 rats in each:the normal control group,curcumin controlgroup,paraquat poisoning group(the rats were given 2ml/kg 2%paraquat solution by gavage),curcumin intervention group (the rats were intraperitoneally injected with 5ml/kg curcurmin at 15 min,24 h,48 h after gavage of paraquat).The behavior changes of rats were observed after treatment.On d1,3 and 7,5 rats in each group were sacrificed and the kidney tissues and serum samples were collected.The blood creatinine(Cr)and urea nitrogen(BUN)levels were measured by SOP-CR and urea assay,respectively,the interleukin(IL)-1β,IL-6,IL-10 and tumor necrosis factor(TNF)-α levels were measured by ELISA.And the expression ofnuclear factor(NF)-κB in nephrotic tissue was detected by Western blotting.Pathological changes of the kidney were observed with light microscopy. Results Compared to the rats in normal control and curcumin control group the rats in paraquat poisoning group increased activity,irritability at 30min after injection,then appeared restless,less active,short of breath, stopped eating and walked staggeringly at 6h after injection,and on d3,the above symptoms were more severe.The symptoms of rats in curcumin intervention group were less severe than that in paraquat poisoning group.Compared to normal control group and curcumin control group,the levels of Cr,BUN and the expression of NF-κB in paraquat poisoning group were increased,and the Cr,BUN levels reached peak on d3,the expression of NF-κB continued to increase on d1,3 and 7.The activity of IL-1β,IL-10 and TNF-α was significantly and reached peak on d3(P＜0.05),the activity of IL-6 continued to increased significantly on d1,3and 7.Compared with the paraquat poisoning group,the level of Cr,BUN and the expression of NF-κB in curcumin intervention group decreased significantly;IL-1β,IL-6,and TNF-α activity was significantly decreased too,and the level of IL-10,however, was significantly increased on d1,3 and 7(all P＜0.05).The pathological examination revealed that the damage of kidney tissue in the paraquat group was the most severe on d3 after paraquat exposure,and the damage was consistently alleviated in curcumin intervention group on d1,3 and 7 as compared with the paraquat group. Conclusion Excessive inflammatory play an important role in paraquat-induced acute kidney damage.Our study shows that curcumin can exert a protective effect on paraquat-induced kidney damage in rats by down-regulate the expression of NF-κB,decreasing the activity of IL-1β,IL-6,TNF-α,decreasing the levels ofCr,BUN,and increasing the activity ofIL-10.