梁思源+呂春爽+安紅艷+李全振+趙寶華

摘 要：為研究錦鯉皰疹病毒3型（KHV-3）ORF126基因編碼蛋白的功能，我們對該蛋白的結(jié)構(gòu)特征進行研究分析。本實驗采用PCR擴增技術(shù)獲得KHV ORF126基因的完整序列，構(gòu)建pMD19-T-ORF 126重組質(zhì)粒，應用生物信息學方法分析ORF126基因編碼蛋白的理化特征。結(jié)果顯示：KHV ORF126基因翻譯合成273個氨基酸；ExPasy預測該蛋白的理論分子量為29.9 kDa，等電點為5.11；信號肽的切割部位最可能位于第19～20位氨基酸之間；跨膜區(qū)位于第145～168位氨基酸；抗原表位預測顯示抗原性良好；編碼蛋白不含N-糖基化位點，含有4個O-糖基化位點和17個磷酸化位點。

關(guān)鍵詞：錦鯉皰疹病毒；ORF126基因；生物信息學

錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpesvirus disease，KHVD）感染錦鯉、普通鯉魚及其變種，該病具有高傳染性和高致病性等特點，春夏秋季節(jié)為高發(fā)期，該病一旦暴發(fā)，難以控制，致死率高達80%～90%，給工業(yè)化水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒3（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）引起的傳染病，屬于異皰疹病毒科鯉魚病毒屬，是一種線性、雙鏈DNA病毒，基因組大小約為295 kb，含有156個開放性閱讀框（ORF），成熟的病毒粒子呈球形，由40種蛋白質(zhì)組成，包括13個囊膜蛋白、3個核衣殼蛋白、2個間質(zhì)蛋白及22個未分類蛋白，病毒核內(nèi)的電子密集區(qū)疑似由病毒基因組組成的核蛋白[3]。

1998年從美國和以色列首次分離得到KHV；2002年4月在我國廣東省某養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)KHV感染，死亡率高達80%以上，后經(jīng)劉葒等用nested-PCR檢測證實導致錦鯉死亡的病原體為KHV[4]；2008年，Rosenkranz等人成功構(gòu)建KHV ORF81原核表達載體，并通過實驗驗證表達的ORF81重組蛋白可用于KHV DNA疫苗的研制；2010年，柯浩等人克隆出囊膜蛋白基因ORF59并高效表達[5]；2011年，周井祥等人成功克隆得到KHV-CJ株ORF81基因并對其編碼的蛋白進行生物信息學分析，為基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[6]。目前，對KHV基因組編碼蛋白功能的研究相對滯后，僅部分較保守的主要囊膜蛋白基因的克隆及免疫原性分析取得進展。隨著生物信息學技術(shù)的迅速發(fā)展，蛋白質(zhì)分子的特異性研究越來越便捷[7-8]。

本實驗以河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站所提供患病錦鯉組織為原料，提取基因組，nested-PCR鑒定KHV的存在，以所提基因組為模板，成功構(gòu)建pMD19-T-ORF126重組質(zhì)粒，應用生物信息學軟件對ORF126基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析，為進一步研究KHV的特異性檢測和基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株與載體

患病錦鯉組織由河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站提供，pMD19-T載體和E.coli DH5α感受態(tài)細胞均購自石家莊天時生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

Easy Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、5K DNA Marker、15K DNA Marker等均購自石家莊天時生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI公布的KHV ORF126基因序列，利用Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計ORF126基因的特異性擴增引物（見表1），并引入EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶位點（劃線部位），送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.4 錦鯉皰疹病毒3型ORF126基因的PCR擴增

以KHV基因組為模板，進行PCR擴增，反應體系如下：10×buffer（含Mg2+），2.5 μL；2.5 mM dNTP，1 μL；10 μM ORF126 F，1 μL；10 μM ORF126 R，1 μL；模板，1 μL；Taq DNA聚合酶，0.5 μL；ddH2O，18 μL。反應條件如下：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，59.8 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.5 錦鯉皰疹病毒3型ORF126基因的克隆及鑒定

按照凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行切膠純化，連接pMD 19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆子，并命名為DH5α（pMD19-T-ORF126），送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI中比對。

1.6 錦鯉皰疹病毒3型ORF126基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用ExPasy在線分析獲取KHV ORF126基因的氨基酸序列，計算該蛋白的等電點和分子質(zhì)量；SingalPv3.0在線分析其信號肽分布，Neural net-work（NN）模型預測信號肽引導蛋白的分泌途徑，Hidden Markov（HM M）模型預測分析該序列信號肽的存在情況，并確定切割位點分布；TMHMM Server v.2.0在線分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；DNAStar 6.0軟件預測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；NetNGlyc1.0和YinOYang1.2在線預測N-糖基化位點和O-糖基化位點；NetPhos 3.1 Server在線預測磷酸化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF126基因克隆載體的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得的DNA片段與目的基因大小相符（圖1），連接pMD19-T克隆載體。經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切驗證成功后（圖2），將質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果在NCBI中比對發(fā)現(xiàn)，該序列與錦鯉皰疹病毒3型ORF126基因序列（ID：11266456）的一致性為100%，說明ORF126基因片段已成功連接到載體。

2.2 ORF126基因編碼蛋白的分子特性及理化特征

ORF126基因大小為822 bp，經(jīng)ExPasy在線分析得到的氨基酸序列顯示：該基因編碼273個氨基酸，序列為：MMRILLLLAAAAMISVS VAERLIHAIDGDLKPYGKGPRIKQIDVDEST LVNMKGRKTIEEPEIRKVCCDAFEFNSVKC DRLRFFMSIGNGITEFDPADALEPDELIVYM SAVPPADTLRYRGKEDDGDHGNSAADEAA YQTKRQLLIDVAFIACVGIAGFAIMSMFCIT KVKSDSFPTVPSIGGGPQSSNNNNKGYELL AGTGDTVVHMDSRGRHRNIVNLCGRMTV LINSRVEEDVEDEPVSHDTHDHGTHHPDL EAPPLPDKKPLVDLITA。預測ORF126編碼蛋白的理論分子量為29 889.05Da，pI值為5.11，含有42個強酸性氨基酸、38個強堿性氨基酸、138個疏水氨基酸、55個極性氨基酸。

2.3 信號肽分析

將ORF126基因編碼的氨基酸序列通過Singal Pv3.0進行信號切割位點的預測。結(jié)果顯示（圖3），NN和HMM預測顯示該蛋白存在信號肽的可能性為1.000，信號肽的切割部位最可能位于第19和20位氨基酸之間。

2.4 跨膜區(qū)分析

TMHMM預測ORF126具有一個跨膜區(qū)在145～168位氨基酸（圖4），N末端可能為跨膜區(qū)，C末端位于病毒膜內(nèi)區(qū)。

2.5 KHV ORF126蛋白親水性、柔韌性、抗原指數(shù)以及表面可及性的預測

利用DNAStar子程序Protean對KHV ORF 126蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示（圖5），該蛋白中有5個主要區(qū)域親水性較好，有9個區(qū)域的抗原指數(shù)較高，7個主要區(qū)域表面可及性好，而柔韌性好的區(qū)域分布相對平均。

2.6 潛在糖基化及磷酸化位點預測

Net NGlyc1.0分析顯示ORF126氨基酸序列無潛在N-糖基化位點；YinOYang1.2分析顯示該序列存在4個潛在的O-糖基化位點，分別位于第181、188、189、243位氨基酸；Net Phos 3.1 Server分析預測得出，當閾值為0.5時，存在17個潛在磷酸化位點，包括11個絲氨酸和6個蘇氨酸。

3 討論

1998年，錦鯉皰疹病毒病在以色列首次暴發(fā)，同年，研究人員通過人工感染試驗證實病原體為KHV，并分離出KHV。KHV的傳染性極強，健康鯉魚一旦接觸到已感染的鯉魚或者水，就會被感染，給鯉魚養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。目前，已有研究表明以主要囊膜蛋白基因為模板檢測KHV靈敏度更高[9-10]，對KHVD進行防治的有效方法是免疫，而基因工程疫苗是最為安全有效的選擇[11]，本實驗選用KHV-3 ORF126基因進行克隆及生物信息學分析，為進一步研究該病毒的致病機理及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

本研究通過PCR擴增技術(shù)獲得KHV ORF126基因的完整序列，構(gòu)建pMD19-T-ORF126重組質(zhì)粒，測序后進行生物信息學分析，結(jié)果顯示ORF126基因編碼273個氨基酸，預測ORF126基因編碼蛋白的理論分子量為29.9 kDa，等電點為5.11；使用Neural net-work（NN）和Hidden Markov（HM M）兩種模型預測ORF126基因編碼的蛋白質(zhì)信號肽的切割部位最可能位于第19和20位氨基酸之間[12-14]，信號肽是一段引導新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，對蛋白質(zhì)的定位起到非常重要的作用，信號肽不僅可以提高外源基因的表達量，還可以解決外源蛋白易形成包涵體的問題；TMHMM預測ORF126編碼的蛋白質(zhì)具有一個跨膜區(qū)，位于第145～168位氨基酸[15]，由于膜蛋白可以與膜結(jié)合，較難分離提純，所以需要用軟件分析方法對氨基酸序列的跨膜區(qū)進行預測；利用DNA Star 6.0分析ORF126基因編碼蛋白質(zhì)的生理生化特征，可預測其親水性、柔韌性、抗原指數(shù)以及表面可及性，結(jié)果顯示該蛋白抗原性良好，對病毒的致病性起重要作用；使用在線軟件分析得出該蛋白無N-糖基化位點，含有4個潛在的O-糖基化位點，以及17個潛在的磷酸化位點[16]；本實驗研究結(jié)果對該疾病的檢測及基因工程疫苗的開發(fā)具有重要意義[17-18]；

參考文獻：

[1] Iida T， Sano M.Koi herpesvirus disease[J].Uirusu，2005，55（1）：145-51.

[2] 朱霞，王好，李新偉，等.錦鯉皰疹病毒病的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學，2011（1）：106-110.

[3] 袁海延，于慧，王好，等.錦鯉皰疹病毒病的研究進展[J].中國獸藥雜志，2015，49（5）：62-65.

[4] 劉葒，史秀杰，高隆英，等.進口錦鯉暴發(fā)病病原的nested—PCR鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2002，21（5）：414-418.

[5] 柯浩，劉振興，林敏，等.錦鯉皰疹病毒囊膜蛋白ORF59的克隆、分析及其主要B細胞表位區(qū)的原核表達[J].南方水產(chǎn)，2010，06（4）：56-62.

[6] 周井祥，李新偉，王好，等.錦鯉皰疹病毒-CJ株ORF81基因的克隆及生物信息學分析[J].水產(chǎn)學報，2011，35（12）：1780-1786.

[7] 楊毅，李莉娟，陳孝煊，等.錦鯉皰疹病毒ORF134基因的克隆與表達[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2013（4）：100-105.

[8] 袁海延，于慧，周景祥，等.錦鯉皰疹病毒ORF146基因的克隆、表達及免疫原性的研究[J].中國獸藥雜志，2015，49（6）：13-16.

[9] 烏日琴，陳芳，張藝宜，等.多重PCR方法檢測錦鯉皰疹病毒基因[J].中國動物檢疫，2011，28（11）：39-43.

[10] 孟慶峰，錢愛東，王偉利.檢測錦鯉皰疹病毒方法的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（17）：27-29.

[11] 田園園，葉星.魚用基因工程疫苗研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2012，14（5）：145-152.

[12] 韋雪芳，王冬梅，劉思，等.信號肽及其在蛋白質(zhì)表達中的應用[J].生物技術(shù)通報，2006（6）：38-42.

[13] Schultz U，Kck J，Schlicht H J，et al.Recombinant duck interferon：a new reagent for studying the mode of interferon action against hepatitis B virus[J].Virology，1995，212（2）：641-9.

[14] 鄭斌，詹希美.信號肽序列及其在蛋白質(zhì)表達中的應用[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（3）：296-298.

[15] 陳鐘強，劉琪，朱貽盛，等.膜蛋白跨膜區(qū)預測方法的評價[J].生物化學與生物物理學報（英文版），2002（3）：285-290.

[16] Weerapana E，Imperiali B.Asparagine linked protein glycosyla-tion：from eu-karyotic to prokaryotic systems[J].Glycobiology，2006，16（6）：91-101.

[17] Gunn P R，Sato F，Powell K F，et al.Rotavirus neutralizing protein VP7：antigenic determinants investigated by sequence analysis and peptide synthesis[J].Journal of Virology，1985，54（3）：791-7.

[18] 閆慧麗，席俊，賀夢雪，等.大豆主要過敏原Gly m Bd 28K的同源建模和B細胞表位的預測[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2016，37（4）：41-45.