UPLC-MS/MS檢測乳品飲料中的四環(huán)素類殘留

李婷婷，韋曙光，彭艷

（1.貴州民族大學化學與生態(tài)環(huán)境工程學院（民族醫(yī)藥學院），貴州貴陽550025；2.貴州省水利水電勘測設(shè)計研究院，貴州貴陽550001）

UPLC-MS/MS檢測乳品飲料中的四環(huán)素類殘留

李婷婷1，韋曙光2，彭艷1

（1.貴州民族大學化學與生態(tài)環(huán)境工程學院（民族醫(yī)藥學院），貴州貴陽550025；2.貴州省水利水電勘測設(shè)計研究院，貴州貴陽550001）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳品飲料中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素殘留的分析方法。樣品前處理用乙腈沉淀蛋白后，采用HLB小柱進行凈化和富集。采用Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分離，以0.1%甲酸-乙腈為流動相的梯度洗脫模式下，4種四環(huán)素類抗生素在1.0 ng/mL～200.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù) r2為 0.998 5～0.999 2，檢出限為 0.5 μg/kg～2.0 μg/kg，定量限為 1.5 μg/kg～6.0 μg/kg，加標回收率達到82.5%～91.5%。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；乳品飲料；四環(huán)素類

antibiotics

四環(huán)素類抗生素為廣譜抗菌藥，被廣泛用作藥物添加劑，用于預(yù)防和治療畜禽疾病。隨著動物源性食品需求的急劇增長，該類藥物的濫用、超量使用、不遵守休藥期規(guī)定等一系列不合理用藥現(xiàn)象嚴重，導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留問題不斷增多，已經(jīng)涉及到乳及乳制品，對公眾的健康帶來潛在危害。

目前常用的四環(huán)素類抗生素有：四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素等，檢測方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法等[1-10]。但是已有的方法常有靈敏度不高，前處理繁瑣、檢測藥物單一或重現(xiàn)性不好等問題，很難滿足對藥物殘留的同時確證檢測。本試驗所用的方法結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強的優(yōu)勢。特別是在前處理階段采用固相萃取技術(shù)，對于復(fù)雜樣品的分析檢測，不僅可以避免基質(zhì)干擾等問題，而且可以起到一個富集目標物的作用，分析鑒定以往難于辨識的痕量成分。本方法針對4個四環(huán)素類藥物建立了一種快速簡便、專屬性強、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，在實驗室的推廣可行性較高，可為乳品飲料中四環(huán)素類抗生素殘留的監(jiān)督檢驗和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；API4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司。

四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素標準品：購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；HLB小柱、PEP小柱、C18小柱：規(guī)格 6cc，500 mg，Agilent公司。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；

流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；

流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序：0～1.5 min 80%A；1.5 min～6 min 80%A →30%A；6 min～9 min 30%A →80%A；10 min 80%A。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜進樣模式選用針泵連續(xù)進樣，離子模式選擇ESI+，先對4種抗生素類目標物進行母離子全掃描，再對4種抗生素類目標物子離子進行全掃描，分別選定4種目標物的定性離子和定量離子，并優(yōu)化質(zhì)譜的噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)。

1.3.2 標準曲線的制作

稱取一定量的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素標準品，配制成濃度為 1.0、5.0、10.0、100.0、200.0 ng/mL的標準溶液，由超高效液相色譜儀進質(zhì)譜儀分析，繪制相應(yīng)的外標標準曲線。

1.3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

目標樣品中含有較復(fù)雜的食品基質(zhì)，前處理階段要求既要除去雜質(zhì)又要減少目標物的損失，所以對4種提取溶劑以及3種固相萃取小柱進行比較，選擇較優(yōu)的前處理條件。

1.3.4 加標回收試驗及樣品測定

在空白基質(zhì)中加入4種目標物的標準溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件和質(zhì)譜條件，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜進樣模式選用針泵連續(xù)進樣，離子模式選擇ESI+，分別對濃度為500 ng/mL的四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各母離子的去簇電壓和錐孔電壓。再在上述條件的基礎(chǔ)上，對其子離子進行全掃描，選擇各自兩組豐度最高的離子，較高一個作為定量離子，另一個作為定性離子，并對質(zhì)譜檢測的噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描時間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進行優(yōu)化。

優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：噴霧電壓5 000 V、離子源溫度550℃、氮氣流量25 L/min、掃描時間50 ms，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4種四環(huán)素類的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 4 tetracycline antibiotics

依照表1優(yōu)化后的條件，質(zhì)譜選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行檢測，4種四環(huán)素類抗生素能在10 min內(nèi)快速分離，結(jié)果如圖1所示。

2.2 標準曲線的制作

為了驗證四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素等4種目標物在儀器中的線性關(guān)系，準備了濃度為1.0、5.0、10.0、100.0、200.0 ng/mL 5 個梯度的系列混合標準溶液，將其上機進行檢測。

試驗結(jié)果如表2所示，4種抗生素在1.0 ng/mL～200.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r2在0.998 5～0.999 2之間，線性關(guān)系良好，4種目標物的檢出限在0.5 μg/kg～2.0 μg/kg 之間，定量限在 1.5 μg/kg～6.0 μg/kg之間。

2.3 提取溶液的優(yōu)化

在對四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素等4種四環(huán)素類抗生素提取的過程中，4種抗生素易被乳品飲料中的蛋白質(zhì)所吸附，所以在前處理過程中既要考慮蛋白質(zhì)的去除也要避免目標成分被蛋白質(zhì)沉淀所吸附。本試驗參考相關(guān)文獻[11-14]，比較了5%鹽酸、甲醇、乙醇、乙腈等4種提取溶液對4種目標物的提取效果。

圖1 4種四環(huán)素類的MRM圖Fig.1 MRM chromatogram of 4 tetracycline antibiotics

表2 4種四環(huán)素類抗生素的保留時間、標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 4 tetracycline antibiotics

圖2 提取溶液對4種四環(huán)素類平均回收率的影響Fig.2 The effect of extract solution on the average recovery rate for the four kinds tetracycline antibiotics

結(jié)果如圖2所示，4種提取溶劑中，當5%鹽酸作為提取溶劑時，乳品飲料中的蛋白質(zhì)沉淀不充分，提取液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象；當甲醇、乙醇以及乙腈為提取溶劑時，乳品飲料中的蛋白質(zhì)沉淀效果明顯，提取液易于分離，其中乙腈的提取效果最好，回收率最高，所以本試驗選擇乙腈作為提取溶液。

2.4 固相萃取柱的選擇

乳品飲料中的基質(zhì)成分復(fù)雜，即使是經(jīng)乙腈提取后的提取液中也含有很多雜質(zhì)干擾目標物在儀器上的響應(yīng)。所以本試驗采用固相萃取小柱對提取液進行進一步的凈化和富集，并比較了常用的硅膠小柱、中性氧化鋁小柱、PEP固相萃取柱、HLB小柱以及C18小柱等5種固相萃取小柱對4種目標物的凈化效果，結(jié)果以4種目標物的平均加標回收率作為比較依據(jù)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比較其他幾款小柱，HLB小柱對樣品提取液的凈化效果最好，加標回收率最高。主要是因為HLB小柱屬于通用型吸附劑，其吸附容量較高，吸附性較強，對基質(zhì)的凈化效果較好，目標物受雜質(zhì)的干擾較小，所以選擇HLB小柱作為乳品飲料提取溶液的凈化和富集的小柱。

2.5 加標回收與相對偏差

在上述優(yōu)化后的前處理條件和儀器條件下，往空白基質(zhì)中加入4種目標組分的標準溶液進行加標回收率試驗，分別添加 1.0、2.0、10.0 μg/kg等系列濃度的標準溶液，每個結(jié)果測定3次。

表3 方法的回收率及相對標準偏差（n=3）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=3）

由表3可見，4種目標組分的加標回收率在82.5%～91.5%之間，RSD在1.8%～3.1%之間，說明本試驗的檢測數(shù)據(jù)的準確度和精密度可行。

2.6 實際樣品的測定

利用本試驗優(yōu)化后處理方法及檢測方法，對市場上隨機購買的30個批次乳品飲料進行測定，結(jié)果良好，未發(fā)現(xiàn)上述4種抗生素藥物殘留。并且對30個批次樣品利用標準GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》[15]進行復(fù)檢，結(jié)果也良好，未檢測出陽性樣品，表明該方法可行，可用于實際樣品的測定。

3 結(jié)論

本試驗建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測乳品飲料中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素藥物殘留的分析方法。結(jié)果表明，通過優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，在MRM掃描模式下，4種抗生素組分能在10 min實現(xiàn)快速的分離和檢測。乳品飲料經(jīng)過乙腈溶液提取沉淀后，提取液再經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化和富集后，可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)，可實現(xiàn)樣品中4種目標組分的分離，能準確快速有效地檢測乳品飲料中的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素的殘留分析。

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Analysis Tetracycline Antibiotics Residues in Dairy Beverage by UPLC-MS/MS

LI Ting-ting1，WEI Shu-guang2，PENG Yan1
（1.School of Chemistry and Eco-Environmental Engineering（School of Chinese Pharmacy），Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Guizhou Survey&Design Reserch Institute for Water Resources and Hydropower，Guiyang 550001，Guizhou，China）

A ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was established for the residues determination of tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline in dairy beverage.After the sample was treated with acetonitrile，it was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm × 150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of 4 tetracycline antibiotics components was in the range of 1.0 ng/mL-200.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.998 5-0.999 2.The detection limit was 0.5 μg/kg-2.0 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg-6.0 μg/kg.The recovery rate was 82.5%-91.5%.

ultra high performance liquid chromatography mass（UPLC-MS/MS）；dairy beverage；tetracycline

2017-02-10

李婷婷（1985—），女（布依），實驗師，碩士，研究方向：分析化學、環(huán)境監(jiān)測；環(huán)境化學。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.039