田海娟　王曉旭　孫天瑤

摘要：利用納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）與馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）對紫蘇（Perilla frutescens）餅粕進行混菌的固態(tài)發(fā)酵，對其發(fā)酵后的產(chǎn)品進行理化分析。結(jié)果表明，在接種量為5%，混菌發(fā)酵溫度為33 ℃的條件下，發(fā)酵2 d，發(fā)酵后紫蘇餅粕中粗蛋白升高3.79個百分點，纖維素降低2.80%，總黃酮升高15.53%。

關(guān)鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）餅粕；混菌發(fā)酵；營養(yǎng)特性；變化規(guī)律

中圖分類號：S816.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2105-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.028

Abstract： Bacillus natto and Kluyveromyces marxianus as the strains of mixed bacteria solid-state fermentation of perilla（Perilla frutescens） seed meal， the physical and chemical analysis of its fermentation products were studied. The results showed that under that condition of inoculation quantity 5%， the optimal temperature 33 ℃，after 2 days mixed bacteria solid-state fermentation， the increase rate of perilla seed meal crude protein was 3.79 percentage points， cellulose degradation rate was 2.80%， and flavonoids increased at a rate of 15.53%.

Key words： perilla （Perilla frutescens） seed meal； mixed fermentation； nutritional properties； change rule

紫蘇子，又稱蘇子、赤蘇子，是紫蘇（Perilla frutescens）的干燥成熟果實，是一種重要的油料經(jīng)濟作物。紫蘇子性溫，無毒，生吃可以止渴潤肺；熟食補中益氣、祛痰止咳、降血壓、平哮喘[1]。紫蘇子中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、非氮物質(zhì)、灰分，其中油脂含量約為45%～55%，蛋白質(zhì)含量占25%。紫蘇子中還含有約12.19 mg/g的黃酮[2]，黃酮類化合物具有多種藥理作用，可以降血脂和膽固醇，改善血液循環(huán)，增強免疫力，還可以抗炎、擴張冠狀動脈、增加冠脈流量、改善高血壓等，具有一定的抗腫瘤和保肝等作用。紫蘇子煉油后獲得的副產(chǎn)品主要是紫蘇餅粕。紫蘇餅粕主要用作飼料，直接飼喂營養(yǎng)成分的利用率不高，造成了浪費，對紫蘇餅粕進行發(fā)酵研究，可以為更好地利用和開發(fā)紫蘇餅粕提供依據(jù)。

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）的原始菌株是枯草芽孢桿菌的一個亞種，是從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出來的[3]，納豆芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝物納豆激酶具有溶血栓、抗腫瘤、抗氧化性及預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用。納豆芽孢較為穩(wěn)定，在酸性胃環(huán)境中仍然保持穩(wěn)定；在腸道中不增值，只在腸道上段迅速發(fā)育轉(zhuǎn)變成代謝活躍的營養(yǎng)型細胞[4]，抑制腸桿菌和腸球菌等的生長，能促進雙厭氧菌的生長。納豆芽孢桿菌在腸道中酸化有利于鐵、鈣等礦物質(zhì)的吸收[5]。馬克思克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）是藏靈菇中的一種重要菌。馬克斯克魯維酵母菌中含有多種對人體健康有益的活性物質(zhì)，包括β-葡聚糖。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，酵母β-葡聚糖具有刺激免疫、降低膽固醇、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等功能。本試驗利用納豆芽孢桿菌與馬克思克魯維酵母菌對紫蘇餅粕進行混菌的固態(tài)發(fā)酵，對其發(fā)酵后的產(chǎn)品進行理化分析，以期為紫蘇餅粕的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌種 納豆芽孢桿菌、馬克思克魯維酵母菌由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制造創(chuàng)新實驗室提供。

1.1.2 原料與試劑 紫蘇油粕（吉林洮南百群食品科技有限公司）；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉（分析純）、葡萄糖、甲基紅（分析純）、溴甲酚綠（分析純）、硝酸鋁（分析純）（天津市北辰方正試劑廠）；MRS培養(yǎng)基（廣東省環(huán)凱微生物有限公司）；無水硫酸銅、硼酸（天津市光復(fù)精細化工研究所，分析純）；硫酸鉀、鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、甲醇（北京化工廠，分析純）；氫氧化鈉（上海集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）；纖維素標準品、蘆丁標準品（長春生物制品所）；蒽酮（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純）；亞硝酸鈉（廣東省臺山市化工廠，分析純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 BSC-1300IIA2型超凈工作臺（ 蘇凈蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZHWY-1112C型雙層超大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海雙旭電子有限公司）；FD-1-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；SH220N型石墨消解儀、K1100型海能全自動凱氏定氮儀（濟南海能儀器股份有限公司）；MS7-H550-Pro型磁力攪拌器（上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

1）培養(yǎng)基的制備。LB培養(yǎng)基：牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖5 g，溶解于500 mL去離子水中，pH 7.0～7.2。MRS培養(yǎng)基：稱取固態(tài)MRS培養(yǎng)基26.2 g，加熱溶解于500 mL去離子水中。將制備好的LB培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基分裝至100 mL的三角瓶中，每個三角瓶50 mL，瓶口用報紙包好，扎緊，一同放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃，20 min。滅菌后放冷，備用。

2）馬克思克魯維酵母菌的活化。在超凈工作臺上，將需要使用的全部儀器設(shè)備放入超凈工作臺，除菌種以外。使用前用酒精棉擦拭超凈工作臺臺面，打開紫外燈，照射30 min，關(guān)閉紫外燈，打開送風，用酒精棉再次擦拭臺面并擦手，開始試驗操作。準確吸取0.5 mL馬克思克魯維酵母菌于50 mL MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口捆綁的不要太緊。搖瓶30 ℃培養(yǎng)18 h，此為一代菌液。

3）納豆芽孢桿菌的活化。由于納豆芽孢桿菌為粉末狀，故在接菌時要關(guān)閉送風，點燃酒精燈。靠近酒精燈，將裝有納豆芽孢桿菌的膠囊打開，加少量納豆芽孢桿菌粉末于含50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，棉塞過火，塞好棉塞，蓋好膠囊，三角瓶口包上報紙，用繩子捆好，不要捆綁太緊。在操作過程中不得遠離酒精燈，避免染菌。將接菌的三角瓶放入搖床中，36 ℃培養(yǎng)18 h，此為一代菌液。

1.2.2 菌種的傳代培養(yǎng) 分別取1%一代菌液于各自的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，此為二代菌液。

1.2.3 原料處理 紫蘇子經(jīng)超臨界CO2技術(shù)（壓力25 MPa，溫度40 ℃，流量20 L/h，1 L萃取釜萃取90 min）萃取紫蘇子油，剩下的紫蘇餅粕進行超微粉碎處理，冷凍保藏。準確稱取40 g紫蘇餅粕超微粉放入藍蓋瓶中，121 ℃、20 min高壓蒸氣滅菌后備用。

1.2.4 單菌固態(tài)發(fā)酵試驗 無菌條件下進行，每個藍蓋瓶中加入60 g無菌水（紫蘇子粕與水的比例為1.0∶1.5，g∶mL，下同），用玻璃棒充分攪拌均勻。接種5%（即5 mL）納豆芽孢桿菌菌液，分別放入30、33、36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。分別接入5%馬克思克魯維酵母菌，其接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間與納豆芽孢桿菌相同。發(fā)酵后滅菌凍干備用。

1.2.5 混菌發(fā)酵試驗 取3個含有與無菌水混合的紫蘇餅粕藍蓋瓶，每個加入5%（即5 mL）混合菌液，納豆芽孢桿菌與馬克思克魯維酵母菌的比例為1∶1。將3個接菌的藍蓋瓶分別放入30、33、36 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，做3個未接菌的空白，培養(yǎng)條件同上，發(fā)酵后滅菌凍干備用。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)品成分分析 按照試驗設(shè)定的發(fā)酵條件對紫蘇餅粕進行發(fā)酵，分析其粗蛋白質(zhì)、纖維素、總黃酮含量的變化。

1）粗蛋白質(zhì)含量測定。根據(jù)GB/T 50095-2010檢測紫蘇餅粕的粗蛋白質(zhì)含量。

2）纖維素測定。纖維素測定采用比色法。準確吸纖維素標準溶液5.0 mL至50 mL容量瓶中，加去離子水至刻度線，混合均勻，即纖維素含量0.1 mg/mL。繪制纖維素標準曲線，如圖1所示。測定待測樣品吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品的纖維素含量。

3）總黃酮含量的測定。配制蘆丁標準液，蘆丁含量0.2 mg/mL。標準曲線的繪制：準確吸取蘆丁標準液1、2、3、4、5 mL分別于25 mL容量瓶中，各加水至5 mL；然后加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混合均勻，靜置6 min；再加10%硝酸鋁1 mL，混合均勻，靜置6 min；加氫氧化鈉溶液10 mL，再加去離子水稀釋至刻度線，混合均勻，靜置15 min，以相應(yīng)的試劑做空白試驗。使用紫外-可見分光光度計在500 nm處分別測定5個標準液的吸光度。橫坐標為蘆丁濃度，縱坐標為吸光度，繪制標準曲線如圖2所示。

準確稱取樣品0.5 g于25 mL比色管中，加甲醇至刻度線，置于超聲波清洗器中，溫度為70 ℃，功率為70%，提取70 min[6]。提取后溶液過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，濾渣用甲醇沖洗后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容。按照標準曲線制備的方法進行檢測并計算其總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵粗蛋白質(zhì)含量的變化

不同溫度混菌發(fā)酵紫蘇餅粕粗蛋白質(zhì)含量的變化如圖3所示。發(fā)酵后的紫蘇餅粕粗蛋白質(zhì)含量均有所提高，其原因可能是微生物中含有20%左右的干物質(zhì)，干物質(zhì)由蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸礦物質(zhì)等物質(zhì)組成，隨著發(fā)酵時間的增長微生物也隨之增長，樣品中微生物的干物質(zhì)增多，再加上菌種自身的菌體蛋白質(zhì)含量較高，經(jīng)發(fā)酵后，菌種大量繁殖，致使總的粗蛋白質(zhì)含量升高；且微生物生長繁殖的過程中中間代謝產(chǎn)物的生成也會增加粗蛋白質(zhì)的含量。從圖3可以看出，混菌發(fā)酵的紫蘇餅粕比未經(jīng)發(fā)酵的、經(jīng)納豆芽孢桿菌與馬克思克魯維酵母菌單菌發(fā)酵的粗蛋白質(zhì)含量高；不同溫度下的混菌固態(tài)發(fā)酵紫蘇餅粕粗蛋白質(zhì)的含量由多至少依次為33 ℃>30 ℃>36 ℃。

2.2 混菌發(fā)酵纖維素含量的變化

不同溫度混菌固態(tài)發(fā)酵紫蘇餅粕纖維素含量的變化如圖4所示。固態(tài)發(fā)酵后的纖維素含量降低，其原因是微生物的生長繁殖將纖維素作為碳源，將大分子的纖維素分解為小分子加以吸收利用，而使纖維素含量下降。從圖4可以看出，混菌發(fā)酵比未發(fā)酵、經(jīng)納豆芽孢桿菌及馬克思克魯維酵母菌單菌發(fā)酵的纖維素含量低；不同溫度下混菌發(fā)酵紫蘇餅粕纖維素含量由少至多依次為33 ℃>30 ℃>36 ℃。

2.3 混菌發(fā)酵總黃酮含量的變化

不同溫度混菌固態(tài)發(fā)酵紫蘇餅粕總黃酮含量的變化如圖5所示。經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后的紫蘇餅粕其總黃酮含量升高，其原因是紫蘇餅粕發(fā)酵產(chǎn)生了一些物理或生物化學(xué)變化，微生物可以改變紫蘇餅粕其原有的化學(xué)成分含量，也可能與微生物的代謝有關(guān)。從圖5中可以看出，混菌發(fā)酵比未發(fā)酵、經(jīng)納豆芽孢桿菌及馬克思克魯維酵母菌單菌發(fā)酵的總黃酮含量高；不同溫度下混菌發(fā)酵紫蘇餅粕總黃酮含量由多至少依次為33 ℃>30 ℃>36 ℃。

3 小結(jié)

試驗利用納豆芽孢桿菌與馬克思克魯維酵母菌對紫蘇餅粕進行單菌與混菌的固態(tài)發(fā)酵，對其發(fā)酵后的紫蘇餅粕進行理化分析。結(jié)果顯示，經(jīng)微生物固態(tài)發(fā)酵后的紫蘇餅粕其粗蛋白質(zhì)及總黃酮含量均有不同程度升高，纖維素含量有所下降，經(jīng)過對比得知混菌發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵最佳溫度為33 ℃。紫蘇餅粕接種5%的混菌，33 ℃發(fā)酵2 d：粗蛋白質(zhì)含量由30.74%上升到34.53%，升高3.79個百分點；纖維素含量由384.97 mg/g下降到374.38 mg/g，降低2.80%；總黃酮含量由11.42 mg/g上升到13.52 mg/g，升高15.53%。

參考文獻：

[1] 李英霞，彭廣芳.紫蘇子的本草考證[J].中醫(yī)藥研究，1996（3）：60-61.

[2] 鄒 茜.淺談紫蘇不同居群不同部位總黃酮含量的差異[J].當代醫(yī)藥理論，2014（9）：32-34.

[3] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].第八版.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰氏的菌鑒定手冊》翻譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984.

[4] 劉學(xué)劍.微生態(tài)理論與綠色飼料添加劑的開發(fā)應(yīng)用[J].湖南飼料，2000，59（5）：2-7.

[5] 王旭冰，婁永江.納豆芽孢桿菌的開發(fā)與利用[J].中國調(diào)味品，2010（4）：28-31，34.

[6] 宋繼偉.紫蘇籽餅粕黃酮類物質(zhì)的提取及抗菌性研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.