栗亞美， 安展飛， 陳阿娜， 楊艷坤， 白仲虎

(1． 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 2． 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

N端9個(gè)谷氨酸或7個(gè)天冬氨酸顯著增強(qiáng)普魯蘭酶在大腸桿菌中表達(dá)分泌

栗亞美1,2,3， 安展飛1,2,3， 陳阿娜1,2,3， 楊艷坤1,2,3， 白仲虎1,2,3

(1． 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 2． 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

各種標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌分泌表達(dá)異源蛋白，其中最簡(jiǎn)單有效地便是氨基酸標(biāo)簽，尤其是帶電荷氨基酸標(biāo)簽。為了研究N端添加不同種類和數(shù)目的帶電荷氨基酸標(biāo)簽對(duì)普魯蘭酶(pullulanase,BaPul13A)在大腸桿菌中表達(dá)分泌水平的影響，構(gòu)建了25株BaPul13A變體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：N端添加9個(gè)連續(xù)的谷氨酸標(biāo)簽，降低了mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，增加了N端mRNA的穩(wěn)定性，使得普魯蘭酶總酶活達(dá)到179.60 U/mL，比不添加氨基酸標(biāo)簽的對(duì)照菌高278.28%。N端添加7個(gè)連續(xù)的天冬氨酸標(biāo)簽，增強(qiáng)了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜通透性，大量的普魯蘭酶，48.18 U/mL，分泌到培養(yǎng)基中。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件I-TASSER分析得知，N端添加不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽引起CBM41結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，猜測(cè)該變化是導(dǎo)致BaPul13A變體表達(dá)分泌水平差異的主要原因。

帶電荷氨基酸標(biāo)簽；表達(dá)分泌；mRNA；膜通透性；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

大腸桿菌，因其豐富而配套的載體和菌株系統(tǒng)，以及內(nèi)在的蛋白分泌系統(tǒng)，被稱為一類完美的宿主[1-2]。在大腸桿菌中，蛋白質(zhì)通過氨基酸末端信號(hào)序列的引導(dǎo)，穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)空間或者胞外[3]，無論是在N端或是C端，序列的改變都會(huì)引起異源蛋白表達(dá)分泌水平的差異[4-7]。Kim等[1]提到N端添加5個(gè)連續(xù)的天冬氨酸標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)脂肪酶B分泌，上清脂肪酶B產(chǎn)量達(dá)到65 U/mL，Kato 等[8]在牛胰蛋白酶抑制劑變體(BPTI-22) C端添加了5個(gè)賴氨酸標(biāo)簽后，可溶性產(chǎn)量提高了6.2倍，而Yamane 等[9]證明，在信號(hào)肽后面引入堿性氨基酸殘基會(huì)抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。

Bacillusacidopullulyticus酸性普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶(BaPul13A)，是一種專一性切割 α-1,6糖苷鍵的淀粉脫支酶，在工業(yè)上，與專一性切割 α-1,4糖苷鍵的淀粉酶共同作用，完成淀粉分解過程[10-12]。目前，工業(yè)化的BaPul13A是在地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis中進(jìn)行可溶性表達(dá)和分泌的[10]。由于BaPul13A蛋白分子質(zhì)量大，在大腸桿菌中很難實(shí)現(xiàn)大量可溶性表達(dá)甚至分泌。而一些傳統(tǒng)的可溶蛋白載體[8]如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)[13]和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)[14]，分子量較大甚至?xí)茐哪康牡鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功能。氨基酸標(biāo)簽(SEP-tags, 可溶性增強(qiáng)標(biāo)簽)分子質(zhì)量小，同時(shí)也能起到提高目的蛋白可溶性和分泌性的效果，甚至在目的蛋白未折疊時(shí)就會(huì)發(fā)揮作用[8]。所以氨基酸標(biāo)簽是用來可溶性表達(dá)和分泌大分子蛋白最合適的選擇。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于氨基酸標(biāo)簽的研究很少，主要集中在組氨酸標(biāo)簽上[15]，并且對(duì)不同氨基酸標(biāo)簽對(duì)普魯蘭酶表達(dá)和分泌的差異影響不甚了解，同時(shí)對(duì)造成這種差異的原因也沒有進(jìn)行過探究。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用許多傳統(tǒng)方法[10]，都沒有實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶的高效表達(dá)和大量分泌。據(jù)此，本文通過構(gòu)建一系列N端帶有不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株，研究N端氨基酸標(biāo)簽對(duì)普魯蘭酶表達(dá)和分泌的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli) BL21(DE3)用于普魯蘭酶表達(dá)。酸性普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶基因(Accession No.Ax203843.1) (pul13A)由上海Invitrogen合成。載體pET28a(+)-pelB-pul13A，含有信號(hào)肽基因pelB和普魯蘭酶基因pul13A，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 基因操作

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增合成N端帶有不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽的普魯蘭酶基因。以pET28a(+)-pelB-pul13A為模板，正反向引物通過特別設(shè)計(jì)并且都含有特定的DNA限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。為了保證限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列(NcoI: CCATGG)恰恰在載體pET28a(+)-pelB-pul13A的pelB信號(hào)肽后面并且避免移碼，我們?cè)谡蛞飪?nèi)切酶識(shí)別序列后添加了兩個(gè)密碼子CC變成CCATGGCC，因此正向引物編碼的氨基酸都含有丙氨酸。在每個(gè)PCR反應(yīng)中反向引物pul13A+XhoI (5′-CCGCTCGAGTTATTGTTTGAGAATAAGCGTACTTATAGC-3′)均相同。比如，利用正向引物(5′-CATGCCATGGCCGATGATTCTACTTCGACTAAAGTTATTGTTC-3′)和反向引物pul13A+XhoI可以擴(kuò)增出N端帶一個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽的重組普魯蘭酶基因。然后，將PCR產(chǎn)物和載體用NcoI和XhoI消化，T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)。轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證后用于后期發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。重組菌株名稱，PCR引物及添加的氨基酸標(biāo)簽如表1。

表1 N端添加標(biāo)簽類型及其對(duì)應(yīng)的PCR引物

( )n代表括號(hào)內(nèi)的元素重復(fù)n次；丙氨酸：Ala或A；天冬氨酸：Asp或 D；谷氨酸：Glu或E；組氨酸：His或H；精氨酸：Arg或R；賴氨酸：Lys或K

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

N端帶有不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽的BaPul13A變體菌BL21(DE3)于-80℃保存在25%甘油中，用添加了50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基(5 g/L 酵母提取物, 10 g/L 蛋白胨, 10 g/L NaCl) 37℃，230 r/min過夜培養(yǎng)活化?；罨越KD600 nm=0.05轉(zhuǎn)接到新鮮的含有50 μg/mL卡那霉素的TB/SB培養(yǎng)基(12 g/L 蛋白胨, 24 g/L 酵母提取物, 2.31 g/L KH2PO4, 12.55 g/L K2HPO4；3H2O, 10 g/L glycerol, pH=7.0)中，37℃，230 r/min培養(yǎng)5 h后，添加0.1 mol/L IPTG，改變培養(yǎng)溫度為20℃、230 r/min培養(yǎng)20 h收獲，用于酶活測(cè)定和SDS-PAGE。

1.4 細(xì)胞分級(jí)處理

取發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，上清代表胞外可溶組分(ESF)。周質(zhì)空間組分通過滲透沖擊法獲得[16]。菌體沉淀經(jīng)50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH=9.0)洗滌2次，然后加入等體積的OS緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl、 20% 蔗糖、1 mmol/L EDTA、pH=8.0)，室溫緩慢攪拌10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清定義為OS組分(OSIF)，沉淀加入等體積冰凍的5 mmol/L MgSO4，冰上緩慢攪拌10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清即為OS組分(OSIIF)。沉淀溶解在50 mmol/L Tris-HCl buffer (pH=9.0)中，超聲破碎(功率20%，超聲2 s，停2 s，20 min)，12 000 r/min 4℃離心10 min，上清即為胞內(nèi)可溶組分(ISF)。分離的所有組分保存在-80℃。

1.5 普魯蘭酶活的測(cè)定

通過DNS法[17]測(cè)定普魯蘭酶酶活，原理是DNS和還原糖(由普魯蘭酶分解普魯蘭多糖產(chǎn)生)的氧化還原反應(yīng)，0.1 mL粗酶液(上清組分或周質(zhì)空間組分)加入到含有0.2 mL 1%普魯蘭糖的100 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液的EP管內(nèi)，混勻，60℃水浴10 min，迅速加入0.45 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)，沸水浴10 min，于冰上冷卻后稀釋20倍測(cè)定D540 nm吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出酶活。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原碳水化合物的毫克數(shù)，其還原力相當(dāng)于產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.6 生物信息學(xué)工具

為了研究N端含有不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽的BaPul13A的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，我們用軟件Iterative Threading ASSEmbly Refinement (I-TASSER)進(jìn)行預(yù)測(cè)[18]，鏈接是http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/。為了計(jì)算N端mRNA最小自由能，我們用軟件hybrid-ss-min program進(jìn)行預(yù)測(cè)[19]，鏈接是http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3。

1.7 熒光定量PCR

新鮮的菌體沉淀用RNA提取試劑盒(Tiangen, China)提取RNA。提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,China)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。定量PCR體系按照SYBRPremixEXTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, China)試劑盒說明書配制。用來檢測(cè)普魯蘭酶基因的引物(the forward primer: 5′-CGCGATTTTTCGATTGATGCTA-3′, the reverse primer: 5′-GCTGTTCCTTCTGGAGTTGTGGC-3′) ，以及內(nèi)參基因16 sRNA引物(the forward primer: 5′-TCGGGAACCGTGAGACAGG-3′, the reverse primer: 5′-CGGACTACGACGCACTTTATGAG-3′)均由蘇州金唯智公司合成。所用儀器是Applied Biosystems(USA)。

1.8 細(xì)胞內(nèi)外膜通透性的測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)外膜通透性的測(cè)定方法根據(jù)文獻(xiàn)[20]并作適當(dāng)調(diào)整：12 000 r/min 5 min離心收集菌體，用PBS洗滌2次，固定終D600 nm=0.5。取經(jīng)過上述處理的新鮮菌液200 μL，于96孔板中加入1.1 g/L鄰硝基苯β-D-半乳糖苷(ONPG) 20 μL或頭孢硝噻吩(Nitrocefin) 20 μL，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)D420 nm或者D500 nm變化來表示內(nèi)膜或外膜通透性的改變。

2 結(jié)果和討論

2.1 N端不同帶電荷氨基酸標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株的構(gòu)建

為了分析N端帶電荷氨基酸標(biāo)簽對(duì)BaPul13A表達(dá)分泌的影響，我們構(gòu)建了25株普魯蘭酶變體菌株。包含2個(gè)負(fù)電荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)，3個(gè)正電荷氨基酸(組氨酸、精氨酸、賴氨酸)及其不同數(shù)目的組合。比如，L1(L6、L11、L16和L21)菌株是N端帶有1個(gè)Glu (1Asp、1His、1Arg和1Lys)標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株。L2 (L7、L12、L17和L22)菌株是N端帶有3個(gè)Glu(3Asp、3His、3Arg及3Lys)標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株。L3 (L8、L13、L18和L23)菌株是N端帶有5個(gè)Glu(5Asp、5His、5Arg及5Lys)標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株。L4 (L9、L14、L19和L24) 菌株是N端帶有7個(gè)Glu (7Asp、7His、7Arg及7Lys)標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株。L5 (L10、L15、L20和L25)菌株是N端帶有9個(gè)Glu (9Asp、9His、9Arg及9Lys)標(biāo)簽的普魯蘭酶變體菌株。由于丙氨酸是生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)上的中性氨基酸[21]，為了避免移碼，在起始密碼子ATG后面添加了CC，所以GCC恰好在pelB信號(hào)肽和pul13A普魯蘭酶基因起始位點(diǎn)之間。為了實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶更好地表達(dá)分泌并且能夠通過T7 promoter和Lac operator控制本底表達(dá)，PCR所用模板是來自于載體pET28a(+) 和pET22b(+)-pelB-Pul13A 經(jīng)BglII和XhoI雙酶切連接后構(gòu)建的pET28a(+)-pelB-pul13A。

圖1 25株變體菌及對(duì)照菌發(fā)酵后表達(dá)提高量(a)和分泌量(b)

2.2 帶電荷氨基酸標(biāo)簽對(duì)普魯蘭酶BaPul13A表達(dá)分泌的影響

為了系統(tǒng)地研究N端不同帶電荷氨基酸的添加對(duì)普魯蘭酶表達(dá)和分泌水平的影響，我們采用相同的培養(yǎng)和操作方法處理25株普魯蘭酶變體菌株及不添加氨基酸標(biāo)簽的對(duì)照菌株。各組分酶活(表2)和SDS-PAGE(圖2)如下：

圖2 不同帶電荷氨基端重組普魯蘭酶SDS-PAGE分析

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次且平均值的標(biāo)準(zhǔn)差小于5%。ESF代表胞外組分酶活，OSIF代表周質(zhì)空間OSI酶活，OSIIF代表周質(zhì)空間OSII酶活，ISF代表胞內(nèi)酶活，TEA代表總酶，TAE/D600 nm代表比酶活。TAE等于ESF、OSIF、OSIIF、ISF之和；表達(dá)提高量等于該菌比酶活與對(duì)照菌比酶活之差再除以對(duì)照比酶活的值；分泌量等于胞外酶活(ESF、OSIF、OSIIF三者之和)與總酶活的比值由表2可知，普魯蘭酶N端添加不同類型和長(zhǎng)度的帶電荷氨基酸標(biāo)簽會(huì)對(duì)普魯蘭酶變體菌株的生長(zhǎng)，可溶性表達(dá)以及分泌表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，促進(jìn)或抑制。以D600 nm為例，除了少數(shù)幾個(gè)菌株(L2、L6、L7、L9、L10和L13)的生長(zhǎng)受到抑制，大部分都有促進(jìn)作用。

對(duì)比表2和圖2可知，目的蛋白分子質(zhì)量約為105.4 ku，各組分酶活的檢測(cè)數(shù)據(jù)與SDS-PAGE一致。

就表達(dá)量而言(表2)，對(duì)照菌帶有pelB信號(hào)肽但是N端沒有帶電荷氨基酸標(biāo)簽，普魯蘭酶表達(dá)量為53.82 U/mL。并且，只要添加合適數(shù)量的不同帶電荷氨基酸都會(huì)對(duì)普魯蘭酶表達(dá)量的提高有所幫助。N端帶有5個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽(5D-pul13A)的L3菌株表達(dá)量較對(duì)照提高了188.46%，N端帶有7個(gè)組氨酸標(biāo)簽(7H-pul13A)的L14菌株表達(dá)量較對(duì)照提高了92.60%，N端帶有1個(gè)精氨酸標(biāo)簽(1R-pul13A)的L16菌株表達(dá)量較對(duì)照提高了169.15%，N端帶有5個(gè)賴氨酸標(biāo)簽(5K-pul13A)的L23菌株表達(dá)量較對(duì)照提高了118.53%，此外N端帶有9個(gè)谷氨酸標(biāo)簽(9E-pul13A)的L10菌株表達(dá)量較對(duì)照提高了278.78%，并且表達(dá)量為最高，179.60 U/mL。在所有的變體菌株中，N端添加負(fù)電荷氨基酸標(biāo)簽(酸性氨基酸標(biāo)簽)的BaPul13A變體，除了L8表達(dá)量與對(duì)照相近以及L1、L5明顯低于對(duì)照外，其他菌株，包括N端帶有E、3E、7E、3D、5D和7D，都對(duì)普魯蘭酶可溶性表達(dá)起到一定的促進(jìn)作用，分別提高235.41%、225.18%、158.89%、84.25%、188.46%和10.77%。添加正電荷氨基酸標(biāo)簽(堿性氨基酸標(biāo)簽)的BaPul13A變體中，7H-BaPul13A的表達(dá)量提高到125.30 U/mL，比酶活是8.84 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達(dá)量提高92.60%；1R-BaPul13A、5R-BaPul13A 的表達(dá)量分別提高到142.28 U/mL、110.89 U/mL，比酶活是12.35 U/mL/D600 nm、6.46 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達(dá)量高169.15%、40.76%；3K-BaPul13A和5K-BaPul13A的表達(dá)量分別提高到110.82 U/mL和120.54 U/mL，比酶活是6.25 U/mL/D600 nm和10.03 U/mL/D600 nm，較BaPul13A的表達(dá)量高36.7%和118.35%，其他的BaPul13A變體表達(dá)量均下降，甚至有些菌株檢測(cè)不到酶活。

就分泌量而言，由圖1、圖2和表2可知，對(duì)照菌表達(dá)的普魯蘭酶基本上無分泌。很明顯，N端7D的L4實(shí)現(xiàn)了普魯蘭酶胞外大量分泌，胞外和周質(zhì)空間總酶活達(dá)到50.07 U/mL，其中上清酶活為48.18 U/mL，分泌蛋白占總蛋白72.30%。其他菌株對(duì)普魯蘭酶分泌沒有產(chǎn)生明顯的影響。有研究表明，正電荷氨基酸殘基，在信號(hào)肽疏水結(jié)構(gòu)域之前，對(duì)蛋白通過細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)起促進(jìn)作用，在信號(hào)肽疏水結(jié)構(gòu)域之后，對(duì)蛋白通過細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)起抑制作用[9]。并且有人提出，多聚賴氨酸會(huì)影響蛋白通過SecYEG的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和效率，隨著多聚賴氨酸數(shù)目增多，相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間會(huì)增加，轉(zhuǎn)運(yùn)效率會(huì)降低[23-24]。有一種猜想認(rèn)為，磷脂雙分子層會(huì)抑制N端帶正電荷氨基酸的蛋白通過，因?yàn)樾盘?hào)肽通過電化學(xué)梯度引導(dǎo)蛋白過膜，N端正電荷氨基酸影響電化學(xué)梯度，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)運(yùn)[25-26]。

2.3 N端氨基酸標(biāo)簽對(duì)pul13A mRNA 和BaPul13A變體菌株細(xì)胞膜通透性影響

2.3.1 N端氨基酸標(biāo)簽對(duì)pul13A mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和N端mRNA穩(wěn)定性影響

在所有的變體中，選取了表達(dá)量相對(duì)較高的5個(gè)菌株(L3、L10、L14、L16和L23)進(jìn)行了熒光定量PCR測(cè)定如表3。通過兩步法測(cè)定pul13A轉(zhuǎn)錄水平，重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線用來檢測(cè)引物可用，以及決定樣品的稀釋倍數(shù)。

表3 不同帶電荷氨基端重組普魯蘭酶mRNA分析

其中C作為對(duì)照，mRNA相對(duì)量為1，其他菌株mRNA相對(duì)量均較對(duì)照組小。在pul13A mRNA相對(duì)量和Pul13A變體比酶活之間存在相反的變化趨勢(shì)，pul13A mRNA相對(duì)量越低，Pul13A變體比酶活越高。L10，pul13A mRNA相對(duì)量最低為0.27，比酶活最高為17.39。同時(shí)，L14，pul13A mRNA相對(duì)量最高為0.58，比酶活為8.84，比L10比酶活低2倍。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，轉(zhuǎn)錄水平的降低有助于mRNA有足夠的時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)和正確折疊，避免形成大量包涵體。

N端mRNA的穩(wěn)定性也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄和mRNA的量，進(jìn)而影響表達(dá)翻譯。我們采用在線預(yù)測(cè)軟件，hybrid-ss-min program，預(yù)測(cè)N端最小自由能。N端預(yù)測(cè)序列包含pelB序列，添加的帶電荷氨基酸標(biāo)簽序列以及從起始密碼子開始的前20個(gè)氨基酸序列。預(yù)測(cè)值越負(fù)代表N端mRNA越穩(wěn)定性。對(duì)比得知，帶負(fù)電荷氨基酸標(biāo)簽的L3和L10，最小自由能較負(fù)，N端mRNA較其他菌株穩(wěn)定。帶正電荷氨基酸標(biāo)簽的L14、L16和L10，最小自由能與不帶氨基酸標(biāo)簽的C菌基本一致。

2.3.2 N端氨基酸標(biāo)簽對(duì)BaPul13A變體菌株細(xì)胞內(nèi)外膜通透性影響

帶電荷氨基酸標(biāo)簽會(huì)影響異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)和分泌[2]。一方面，在成熟序列前端兩個(gè)正電荷氨基酸的存在會(huì)顯著影響蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[9]；另一方面，N端高密度的負(fù)電荷能誘導(dǎo)更多的D5-CalB蛋白從細(xì)胞質(zhì)到周質(zhì)空間的轉(zhuǎn)運(yùn)，并使外膜無序[1]。為了揭示L4菌株中7D-BaPul13A如何高效分泌到培養(yǎng)基中，我們檢測(cè)了L4菌株和對(duì)照菌細(xì)胞內(nèi)外膜通透性。如圖3，L4內(nèi)膜通透性較對(duì)照呈現(xiàn)出明顯地增長(zhǎng)趨勢(shì)，但是外膜通透性較對(duì)照沒有明顯的變化。因此，我們認(rèn)為N端負(fù)電荷氨基酸標(biāo)簽通過增加內(nèi)膜通透性能有效幫助蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。但是，在周質(zhì)空間折疊好的7D-Pul13A通過一些未知的與外膜的相互作用幫助其有效分泌，而非僅僅通過增加外膜通透性。

圖3 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)(a)、外膜(b)通透性

■ 代表L4；●代表對(duì)照菌

3 討論

很明顯，N端或C端不同類型或長(zhǎng)度的氨基酸對(duì)表達(dá)和分泌產(chǎn)生不同的影響[27-28]，但是，我們發(fā)現(xiàn)，在氨基酸的選擇上還是存在一定的規(guī)律可循。比如，N端7個(gè)天冬氨酸能有效增強(qiáng)7D-BaPul13A的分泌，同時(shí)Kim等[1]也提到，N端5個(gè)天冬氨酸標(biāo)簽保證脂肪酶B胞外產(chǎn)量達(dá)到65 U/mL。因此可以通過生物信息學(xué)工具設(shè)計(jì)一個(gè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析，從而發(fā)現(xiàn)內(nèi)在規(guī)律，指導(dǎo)我們選擇合適的氨基酸實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)和分泌。

為了進(jìn)一步闡明25株變體表達(dá)分泌差異機(jī)制，我們用I-TASSER(Iterative Threading ASSEmbly Refinement)，一種通過按等級(jí)劃分的方法預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的原件，對(duì)BaPul13A變體蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。Turkenburg等已經(jīng)得到了Pul13A的晶體結(jié)構(gòu)，由于CBM41結(jié)構(gòu)域處于無序狀態(tài)，所以晶體結(jié)構(gòu)上并沒有CBM41結(jié)構(gòu)域[12]。而我們的氨基酸標(biāo)簽添加在N端，因此我們采用蛋白預(yù)測(cè)軟件I-TASSER方法，預(yù)測(cè)了包含CBM41在內(nèi)的所有結(jié)構(gòu)域(CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH48)；采用Discovery Studio Client進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)分析。

圖4 Pul13A變體蛋白結(jié)構(gòu)(a)及CBM41結(jié)構(gòu)域(b)預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)照菌及25株變體菌普魯蘭酶3D二級(jí)結(jié)構(gòu)圖見圖4-a，顯示除了CBM41結(jié)構(gòu)域外，BaPul13A變體其他結(jié)構(gòu)域與晶體結(jié)構(gòu)域一致；從對(duì)照菌及25株變體菌普魯蘭酶放大后的CBM41結(jié)構(gòu)域可以看出，變體菌中α-螺旋、β-折疊數(shù)目以及無規(guī)則卷曲均發(fā)生變化(圖4-b)。不同的氨基酸標(biāo)簽可以與CBM41結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)而造成CBM41結(jié)構(gòu)域的改變。這和本實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果相一致：CBM41結(jié)構(gòu)域的缺失使得普魯蘭酶酶活大約提高了50倍。因此，CBM41的缺失或改變均會(huì)引起分泌表達(dá)差異。

N端氨基酸標(biāo)簽不僅僅會(huì)增強(qiáng)表達(dá)和分泌，還有很多其他的用途。氨基酸標(biāo)簽，一種可溶性增強(qiáng)標(biāo)簽(SETs)，通過克服可溶性和穩(wěn)定性問題，使得蛋白符合核磁共振技術(shù)要求[29]。而且通過氨基酸標(biāo)簽，而不單是組氨酸標(biāo)簽，可以開發(fā)一種新型的過量表達(dá)和分泌的載體[30]。

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N-terminal 9-glutamine and 7-aspartate tags significantly increase the expression and secretion of pullulanase from
BacillusacidopullulyticusinEscherichiacoli

LI Ya-mei1,2,3, AN Zhan-fei1,2,3, CHEN A-na1,2,3, YANG Yan-kun1,2,3, BAI Zhong-hu1,2,3

(1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology; 2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; 3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Various tags, especially charged amino acids, were widely applied in soluble expression and secretion of heterogenous proteins inEscherichiacolirecent years. To know how the charged amino acids types and numbers influent the Pul13A expression and secretion, 25 Pul13A mutants were constructed, which had different N-terminal amino acid tags. Among them, the nine-glutamine tag could decrease the transcription level and increase the N-terminal mRNA stability, and Pul13A′s activity changed to 179.60 U/mL that was 278.28% higher than the control without any amino acid tag. Meanwhile, the N-terminal seven-aspartate tag enhanced the inner membrane permeability, and secreted massive pullulanse into the culture medium ( 48.18 U/mL ). Furthermore, it was found that the CBM41 structural domain was different in different mutants, which maybe mainly result in the differences of the expression and secretion levels.

charged-amino-acid tags; expression and secretory; mRNA; membrane permeability; protein structure prediction

2016-03-30；

2016-04-14

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(JUSRP51401A)；863項(xiàng)目(2015AA020802)；973項(xiàng)目(2013CB733602)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570034)

栗亞美，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程研究，E-mail: 1198066405@qq.com

白仲虎，教授，主要從事發(fā)酵工程領(lǐng)域科研工作，E-mail: baizhonghu@jiangnan.edu.cn；楊艷坤，副教授，主要從事發(fā)酵工程領(lǐng)域科研工作，E-mail: yangyankun@jiangnan.edu.cn

Q78;TQ925

A

2095-1736(2017)03-0011-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.011