張 燁，王 珂，劉石生,*

（1.海南大學食品學院，海南 海口 570228；2.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 海口 570228）

外源β-葡萄糖苷酶處理結合異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定橡膠籽中氰化物含量

張 燁1，王 珂2，劉石生1,*

（1.海南大學食品學院，海南 海口 570228；2.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 ?？?570228）

研究經(jīng)不同方法脫毒處理后的橡膠籽分別采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法和加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測其氰化物含量。結果表明：采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測出的氰化物含量較低或不存在，而加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測出的氰化物含量明顯高于單獨采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法的檢出值。再對加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法的應用條件進行優(yōu)化后得到最優(yōu)條件為浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL、浸泡pH 5.56。以上條件下，預測的氰化物含量為28.79 μg/g，加標回收率為85.02%～92.04%，測定結果準確可靠。

異煙酸-吡唑啉酮分光光度法；β-葡萄糖苷酶；橡膠籽；氰苷；熱處理

氰化物是含有氰基（—CN）的一類化合物的總稱，屬于劇毒物[1]，這類化合物廣泛存在于自然環(huán)境中[2]，分析化學對其關注已有100多年的歷史，至今仍然受到高度關注[3]，其毒性大、反應快[4]，人們過多攝入此類物質會導致神經(jīng)疾病或中毒[5]。由于氰化物的毒性極大，因此要求在較低質量濃度（ng/mL）條件下被檢出[6]。目前國內(nèi)較先進的測定氰化物含量的方法多為液相色譜法、氣相色譜法[7-8]及離子色譜法[9-10]，氣相色譜主要用于測定簡單氰化物及部分絡合物[11]，并不能精確測定總氰化物的含量。高效液相色譜雖然能測定絡合氰化物，但金屬氰化絡合物易分解，只有在特定的環(huán)境條件下才能較穩(wěn)定存在[12]，離子色譜法受技術條件限制，氰化物的離子色譜分析還尚未完全成熟[13]，因此該方法應用條件較為苛刻。而國標中氰化物的主要檢測方法GB/T 13084—2006《飼料中氰化物的測定》[14]和GB/T 5009.36—2003《糧食衛(wèi)生標準的分析方法》[15]中均采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法[16-17]，該種測定方法是在植物本身含有β-葡萄糖苷酶的情況下由β-葡萄糖苷酶水解氰苷生成氫氰酸[18-20]，才能測出氰化物含量。目前雖然有對木薯、竹筍等食用植物食品中氰苷含量測定的相關研究[21-22]，但在實際測定食品中氰化物含量前食品原材料一般都會進行高溫處理。雖然高溫對脫除植物中所含的部分氰化物有所幫助[23-24]，但高溫條件同時能導致蛋白質變性失活，使食物本身含有的β-葡萄糖苷酶遭到不同程度地破壞，氰苷不能完全被分解，因此會存在使用國標方法檢測出的食品中氰化物含量偏低或不存在，但這并不能說明食物中所含有的氰苷在高溫中被完全除去[25-26]。目前還沒有將食物熱加工后經(jīng)外源β-葡萄糖苷酶處理后檢測其氰化物含量的研究。本實驗以橡膠籽為原材料，先通過對橡膠籽進行不同高溫脫毒方法處理，再經(jīng)外源的β-葡萄糖苷酶處理，然后采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定其氰化物含量，探究氰苷是否在高溫中被完全除去，并跟蹤外源β-葡萄糖苷酶的加入對經(jīng)高溫處理后的橡膠籽中氰化物含量測定的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠籽 海南八一農(nóng)場；β-葡萄糖苷酶由實驗室從橡膠籽中提取。

丙酮、乙酸鋅、酒石酸、酚酞、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉溶液、磷酸鹽緩沖液、乙醇、氰化鉀標準溶液、氯胺T、異煙酸、吡唑啉酮，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠；電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BS124S電子天平德國Sartorius公司；PHS-3C型實驗室pH計 上海偉業(yè)儀器廠；TG16G離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；7230G可見分光光度計 上海精科實業(yè)有限公司。1.3 方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的制備

將橡膠籽外殼敲除，種仁磨碎成粉，用適量丙酮沖洗、抽濾、揮干后制成干粉。稱取一定質量的干粉加蒸餾水均質，均質后6 000 r/min離心20 min，取上清液加入適量丙酮產(chǎn)生沉淀，復溶，得到初步純化的酶，4 ℃保存?zhèn)溆肹27-28]。

1.3.2 酶活力的測定

向10 mL比色管中加入0.1 mL適當稀釋的酶液，同時加入0.3 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.1 mL 10 mmol/L 4-硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷，42 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加1 mol/L Na2CO3溶液終止其反應，加蒸餾水至5 mL，于400 nm波長處測定吸光度。空白對照采用0.1 mL蒸餾水代替酶液進行操作，計算酶活力[29-30]。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 未加入β-葡萄糖苷酶

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質量加入帶塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒，加塞浸泡3～4 h。

1.3.3.2 加入β-葡萄糖苷酶

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質量加入帶塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒后加入一定量β-葡萄糖苷酶酶液并調(diào)節(jié)其pH值在一定范圍，加塞后再水浴浸泡一定時間。

1.3.4 氰化物含量的測定

1.3.4.1 測定方法

參考GB/T 5009.36—2003《糧食衛(wèi)生標準的分析方法》[10]1.3.4節(jié)不同熱處理方法對橡膠籽中氰化物含量測定的影響。

1.3.4.2 空白實驗

取一定量的β-葡萄糖苷酶酶液直接加入到裝有100 mL水的三角瓶中并調(diào)節(jié)其pH值在一定范圍，加塞后再水浴浸泡一定時間后測定氰化物含量。

1.3.4.3 煮橡膠籽（煮樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質量橡膠籽并加入一定質量的水（V（橡膠籽）∶V（水）= 1∶20），分別煮10、20、30、40、60 min后采用1.3.3節(jié)中的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.4.4 蒸橡膠籽（蒸樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質量橡膠籽，分別蒸20、40、60、80、100、120、140 min后采用1.3.3節(jié)的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.4.5 烘烤橡膠籽（烘樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質量橡膠籽加水浸泡12 h后曬干。取一定量曬干后的橡膠籽，分別在130 ℃烘烤5、10、15、20、25、30、35 min后采用1.3.3節(jié)的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.5 外源β-葡萄糖苷酶活性對橡膠籽中氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，高溫脫毒處理后，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒后調(diào)節(jié)浸泡時間、溫度、加酶量和pH值得到最優(yōu)單因素條件再進行響應面分析，得到最優(yōu)結果后再驗證。

1.3.5.1 單因素試驗設計

以氰化物含量為指標，進行單因素試驗設計為：加酶量（5、10、15、20、25、30 U/100 mL）、酶解溫度（常溫、35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（1、2、2.5、3、3.5、4 h）、pH（4、4.5、5、5.5、6.0、6.5、7.0）。

1.3.5.2 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，結合響應面試驗優(yōu)化測定條件對測定結果的影響，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Benhnken design

2 結果與分析

2.1 空白實驗結果

直接在100mL水中分別加入0.1 mL的0、10、20、 30 U/100mL β-葡萄糖苷酶液后水浴浸泡一段時間測得氰化物含量分別為0、0.437、0.679、0.749 μg/mL。由空白實驗結果可看出，加入外源β-葡萄糖苷酶對氰化物含量的測定值的影響只有零點幾，數(shù)據(jù)較小，因此可排除外源β-葡萄糖苷酶對實驗結果的影響。

2.2 煮樣時間對氰化物含量測定的影響

圖1 煮樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 1 Effect of boiling time on the cyanide content in rubber seed

如圖1所示，在相同的前處理條件下，經(jīng)水煮后的橡膠籽在檢測氰化物過程中加入外源β-葡萄糖苷酶和不加外源β-葡萄糖苷酶兩種情況下檢出的氰化物含量有明顯差別，加入β-葡萄糖苷酶的一組測出來的氰化物殘留量更多，說明加入外源β-葡萄糖苷酶對測定結果有一定的影響。水煮40 min后，在不加酶的情況下檢測不出氰化物，說明此時橡膠籽內(nèi)源β-葡萄糖苷酶已經(jīng)完全失活，但是重新加入外源β-葡萄糖苷酶后，依然能檢測出氰化物，說明橡膠籽中的氰苷并沒有被充分降解，在外源酶的作用下仍能生成氫氰酸。說明再檢測過程中加入外源β-葡萄糖苷酶可使氰化物測定結果更加準確。

2.3 蒸樣時間對其氰化物含量測定的影響

圖2 蒸樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 2 Effect of steaming time on the cyanide content in rubber seed

如圖2所示，比較圖1和圖2可知經(jīng)隔水蒸后的橡膠籽氰化物的檢測結果的大體趨勢和2.1節(jié)水煮橡膠籽的檢測結果相同，同樣在加入外源β-葡萄糖苷酶和不加外源β-葡萄糖苷酶兩種情況下檢出的氰化物含量有明顯差別，加入β-葡萄糖苷酶的一組測出來的氰化物殘留量更多，而水煮橡膠籽氰化物去除所用時間更短效率更高。

2.4 烘樣時間對其氰化物含量測定的影響

圖3 烘樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 3 Effect of baking time on the cyanide content in rubber seed

由圖3可知，烘烤樣品主要模擬堅果制作工藝進行，在國標法測出氰化物含量在可食用范圍內(nèi)時再在檢測過程中加入外源β-葡萄糖苷酶后檢測出的氰化物含量會增高，可見加入外源β-葡萄糖苷酶的檢測方法在加熱條件下更加準確。

由此，不同的熱處理方式加工過的原料經(jīng)外源β-葡萄糖苷酶處理后所測定的氰化物含量均有所增高，證明加入外源β-葡萄糖苷酶對氰化物的測定有積極的影響，可對該方法進行深入探究。

2.5 氰化物標準曲線方程

精確取一定量的氰化鉀標準使用溶液，溶解定容稀釋成一系列不同已知質量濃度的溶液，測定其吸光度，并繪制標準曲線得到方程y=3.205 1x+0.000 2（y為吸光度，x為氰離子質量濃度/（μg/mL）），R2=0.999 6，說明方程具有良好線性相關性。

2.6 加入外源β-葡萄糖苷酶單因素試驗結果

2.6.1 浸泡時間對測定結果的影響

圖4 浸泡時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 4 Effect of soaking times on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復3 次實驗檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中加酶量10 U/100 mL、溫度45 ℃、pH 6.5，選擇不同的處理時間（1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）進行單因素試驗，每個處理做2 個重復。由圖4可以看出，酶解時間3 h后氰化物含量變化不大，因此浸泡時間選3 h。

2.6.2 加酶量對測定結果的影響

圖5 加酶量對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 5 Effect of β-glucosidase concentration on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復3 次實驗檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、溫度45 ℃、pH 6.5，選擇不同的加酶量（5、10、15、20、25、30 U/100 mL）進行單因素試驗，每個處理做2 個重復。由圖5可以看出，加酶量達到20 U/100 mL后氰化物含量變化不大，因此浸泡加酶量選20 U/100 mL。

2.6.3 pH值對測定結果的影響

圖6 pH值對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 6 Effect of soaking pH on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復3 次實驗檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、溫度45 ℃、加酶量20 U/100 mL，選擇不同的pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）進行單因素試驗，每個處理做2 個重復。由圖6可以看出，pH值在5.5時氰化物含量達到最大值，因此浸泡pH值選5.5。

2.6.4 浸泡溫度對測定結果的影響

圖7 浸泡溫度對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 7 Effect of soaking temperature on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復3 次實驗檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、pH 5.5、加酶量20 U/100 mL，選擇不同溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）進行單因素試驗，每個處理做2 個重復。由圖7可以看出，浸泡溫度在50 ℃時氰化物含量達到最大值，因此浸泡溫度選50 ℃。

2.7 響應面優(yōu)化試驗結果

響應面試驗設計及結果見表2，方差分析及顯著性比較見表3。利用Design-Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素進行回歸擬合，氰化物含量（Y）的回歸方程Y=24.34-1.04A+0.15B+0.94C+0.79D-0.5AB-1.35AC-0.84AD-0.69BC-0.72BD+0.59CD+0.29A2+ 1.15B2+0.69C2+0.76D2。同時，優(yōu)化4 個影響因素的最佳組合為浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL、浸泡pH 5.56。以上條件下，預測的氰化物含量為28.79 μg/g。

表2 響應面試驗設計及結果（n=5）Table 2 Box-Benhnken design with experimental data (n= 5)

由表3可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項不顯著，說明此模型很理想，用方程Y擬合4 個因素與氰化物含量是可行的。相關系數(shù)R2為0.977 4，表明回歸方程與實際數(shù)據(jù)間具有較好的擬合性；為0.954 7，說明可信度較高。從因素A、B、C、D對氰化物含量的影響來看，因素A、C、D為極顯著（P＜0.01），B不顯著；交互項的影響均為極顯著（P＜0.01）；二次項中除A2為顯著外（P＜0.05），其余均為極顯著（P＜0.01）。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷因素影響的主次，本實驗中因素影響順序依次為A＞C＞D＞B，且各試驗因素對響應值的影響呈二次關系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

分別將模型中A、B、C及D其中2 個因素固定在0水平，得到另外2 個因素間交互作用對氰化物含量Y的子模型，4 個因素間部分兩兩交互作用對檢測氰化物含量的影響的響應面分析結果，如圖8所示。

為了檢驗模型預測的準確性，在最佳條件浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL，浸泡pH 5.56條件下，測得氰化物含量為28.55 μg/g，與預測值基本接近，表明預測值和真實值間有較好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

圖8 兩因素交互作用對氰化物含量的影響Fig. 8 Response surface plots showing the effects of various pretreatment factors on the cyanide content in rubber seed

2.8 加標回收實驗

表4 加標回收實驗結果Table 4 Recovery of cyanide in spiked samples

為了檢驗本實驗方法的準確性，在樣品中加入氰化鉀標準使用液，按實驗方法對其進行加標回收實驗，回收率結果見表4。本實驗樣品中氰化物的加標回收率為85.02%～92.04%，方法準確度較高，可信度好。

3 結 論

實驗結果表明，在不同的熱處理條件下橡膠籽內(nèi)的氰均能去除一半以上，在檢測其氰化物含量過程中單純采用異煙酸-吡唑酮分光光度法所測定出來的氰化物含量較低或不存在，說明一定程度的熱處理使橡膠籽本身含有的β-葡萄糖苷酶遭到不同程度地破壞，氰苷不能完全被分解導致測定值較低。在采用加入外源β-葡萄糖苷酶后的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定的氰化物含量要更高，說明外源β-葡萄糖苷酶對經(jīng)熱處理未完全釋放的氰苷繼續(xù)作用使其分解得到的測定值更高，可見在內(nèi)源酶完全失活而沒有加入外源酶的情況下測出的總氰結果并不可靠，由此本實驗中加入外源β-葡萄糖苷酶后的異煙酸-吡唑酮分光光度法的準確度更高。

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Spectrophotometric Determination of Cyanide Content in Rubber Seeds Using Isonicotinic Acid-Pyrazolone after Exogenous β-Glucosidase Pretreatment

ZHANG Ye1, WANG Ke2, LIU Shisheng1,*
(1. College of Food Science, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Key Laboratory of Tropical Biological Resources, Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228, China)

This study investigated the determination of the residual cyanide content of rubber seeds detoxified by different methods by a spectrophotometric method using isonicotinic acid-pyrazolone with and without exogenous β-glucosidase pretreatment. The results showed that cyanide was undetectable or detectable at a level lower than the actual one by the spectrophotometric method without exogenous β-glucosidase pretreatment, while it was detected at a significantly higher level with the sample pretreatment. The optimized pretreatment conditions were 3.35 h soaking at 45.06 ℃ and pH 5.56 with 24.11 U/100 mL of β-glucosidase added, under which, the predicted cyanide content of rubber seeds was 28.79 μg/g. The recovery of spiked samples ranged from 85.02% to 92.04%. The proposed method was accurate and reliable．

isonicotinic acid-pyrazolone spectrophotometry; β-glucosidase; rubber seed; cyanide; heat treatment

10.7506/spkx1002-6630-201714045

O623.76

A

1002-6630（2017）14-0290-07

張燁, 王珂, 劉石生. 外源β-葡萄糖苷酶處理結合異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定橡膠籽中氰化物含量[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 290-296.

10.7506/spkx1002-6630-201714045. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Ye, WANG Ke, LIU Shisheng. Spectrophotometric determination of cyanide content in rubber seeds using isonicotinic acid-pyrazolone after exogenous β-glucosidase pretreatment[J]. Food Science, 2017, 38(14): 290-296. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714045. http://www.spkx.net.cn

2016-08-03

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31460407）

張燁（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：1551540220@qq.com

*通信作者：劉石生（1977—），男，教授，博士，研究方向為天然植物資源開發(fā)與利用。E-mail：stoneliu77@126.com