趙勇娟，翁 凌,2，顏龍杰，劉孟琦，張凌晶,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)魚(yú)糜制品中蛋清含量

趙勇娟1，翁 凌1,2，顏龍杰1，劉孟琦1，張凌晶1,2，曹敏杰1,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

通過(guò)純化蛋清中主要成分卵清蛋白（ovalbumin，OVA），制備抗OVA多克隆抗體，利用制備的抗體建立魚(yú)糜制品中蛋清定量檢測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法（competitive enzyme linked-immunosorbent assay，c-ELISA）。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳和Western blot結(jié)果顯示，制備的抗OVA多克隆抗體特異性良好。以熱處理的OVA為競(jìng)爭(zhēng)抗原建立的c-ELISA法檢測(cè)限為1.82 mg/kg，組內(nèi)變異系數(shù)為3.1%，組間變異系數(shù)為7.8%，回收率為87.4%～97.2%，表明建立的方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性較高。利用建立的方法對(duì)6 種商品化的魚(yú)糜制品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其蛋清的添加量在2.7～83.5 g/kg之間。本研究為今后魚(yú)糜制品中蛋清含量規(guī)范標(biāo)識(shí)的監(jiān)管提供了重要的技術(shù)支持。

蛋清；卵清蛋白；魚(yú)糜制品；競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法

我國(guó)是水產(chǎn)品生產(chǎn)和加工大國(guó)，2014年水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6 462萬(wàn) t，水產(chǎn)品加工產(chǎn)量為2 053萬(wàn) t，其中，魚(yú)糜制品產(chǎn)量達(dá)到152萬(wàn) t[1]。隨著魚(yú)糜制品產(chǎn)量的增加及魚(yú)漿原料價(jià)格的上漲，更多的低值魚(yú)類(lèi)被用于魚(yú)漿制備。為了提高魚(yú)糜制品的口感，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，部分企業(yè)通過(guò)過(guò)量添加包括蛋清在內(nèi)的非魚(yú)肉蛋白成分，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本并提高制品彈性的效果。食品法典委員會(huì)已經(jīng)宣布，要求在“一般標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽的”8類(lèi)食物過(guò)敏，包括雞蛋[2]。但該類(lèi)非魚(yú)肉蛋白的添加卻沒(méi)有明確標(biāo)識(shí)，損害了消費(fèi)者的利益。作為八大類(lèi)致敏食物之一，雞蛋過(guò)敏原主要存在于蛋清中，包括卵鐵傳遞蛋白、卵類(lèi)黏蛋白、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）以及溶菌酶等，其中卵類(lèi)黏蛋白是最主要的過(guò)敏原，而OVA含量最高，約占蛋清總蛋白的54%[3-4]，這些過(guò)敏原經(jīng)熱處理后仍具有致敏性[5-6]。據(jù)報(bào)道，7歲以下兒童對(duì)雞蛋過(guò)敏率較高[7]，尤其是嬰幼兒，約有0.5%～2%對(duì)雞蛋過(guò)敏，臨床表現(xiàn)為皮炎、哮喘、過(guò)敏性休克，甚至死亡[8]。痕量過(guò)敏原即可引發(fā)過(guò)敏癥狀的發(fā)生，因此，對(duì)食物中含有的蛋清成分進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于食品安全控制也十分必要。目前，有報(bào)道一些應(yīng)用于紅酒中蛋清成分檢測(cè)的方法，如Tolin等[9]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)紅酒中蛋清成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為5 g/L蛋清添加量；Pilolli等[10]采用表面等離子共振技術(shù)以O(shè)VA為靶蛋白對(duì)紅酒中的蛋清組分進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度顯著提高至0.03～0.2 μg/mL。Mattarozzi等[11]采用液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)紅酒中的OVA，其線(xiàn)性范圍為10～800 ng/mL。另外，由于多數(shù)流感疫苗采用雞胚進(jìn)行生產(chǎn)，因此，對(duì)于流感疫苗中OVA的監(jiān)測(cè)也受到廣泛關(guān)注，主要采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法（enzyme linked-immunosorbent assay，ELISA）[12-13]進(jìn)行定量檢測(cè)。大多數(shù)食物都經(jīng)過(guò)各種條件加工，如烘烤和蒸煮，這些處理?xiàng)l件可以改變?nèi)芙舛?，蛋白的結(jié)構(gòu)與生物活性[14]。特別是魚(yú)糜制品制備過(guò)程的特殊加工工藝，使最終產(chǎn)品中的蛋白組分因交聯(lián)等發(fā)生了變化，更加大了檢測(cè)難度。目前為止，仍未有相關(guān)方法應(yīng)用于魚(yú)糜制品中蛋清定量檢測(cè)的報(bào)道。

在蛋清蛋白組分中，OVA含量豐富[15]，且具有良好的熱穩(wěn)定性[16]。因此，本研究以O(shè)VA為標(biāo)志蛋白，制備相應(yīng)的多克隆抗體，建立可靠的魚(yú)糜制品中蛋清的定量檢測(cè)方法，以期為今后規(guī)范魚(yú)糜制品中蛋清的正確標(biāo)識(shí)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

爆汁小魚(yú)丸、閩南脆丸、魚(yú)豆腐及雞蛋 廈門(mén)市集美區(qū)新華都超市。

DEAE-Sepharose樹(shù)脂、Protein A Sepharose樹(shù)脂美國(guó)GE Healthcare公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 立陶宛Fermentas公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti JA-25高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Biologic LP蛋白質(zhì)柱層析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀 法國(guó)Alpha Innotech公司；PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；G:BOX凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA的純化

OVA的純化主要參考Tankrathok等[17]的方法并加以修改。將35 g蛋清于4 倍體積20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.5）中攪拌3 h，離心取上清液上樣于用20 mmol/L的Tris-HCl（pH 7.5）預(yù)平衡的DEAE-Sepharose離子層析柱。用平衡緩沖液流洗后，用含有0～0.1 mol/L NaCl的 20 mmol/L的Tris-HCl溶液（pH 7.5）進(jìn)行洗脫，收集第1個(gè)洗脫峰即為純化的目的蛋白。

1.3.2 OVA的鑒定

將純化的目的蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，經(jīng)考染切膠回收蛋白條帶，送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析。

1.3.3 抗OVA多克隆抗體的制備

將純化的OVA經(jīng)95 ℃處理15 min，取150 μg與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，進(jìn)行皮下肌肉注射新西蘭雄兔，每隔2 周以相同劑量的抗原加強(qiáng)免疫。免疫4 次后，采血，靜置，待血清析出后，2 000×g離心10 min，將上清液與1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液混合，上樣于用0.1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）預(yù)平衡的Protein G Sepharose親和層析柱進(jìn)行抗OVA多克隆抗體的純化。

1.3.4 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[18]的方法，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的膠進(jìn)行分析，即先將制備的樣品與上樣緩沖液混合，95 ℃加熱10 min后，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色，經(jīng)脫色液（甲醇-乙酸-水（3∶1∶6，V/V））脫色至條帶清晰后，用凝膠成像儀記錄結(jié)果。

1.3.5 Western blot分析

參照Towbin等[19]的方法進(jìn)行，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶封閉1.5 h，以抗OVA多克隆抗體為一抗，室溫孵育1.5 h后用含150 mmol/L和0.5%吐溫20的10 mmol/L Tris-HCl（TBST），pH 7.4洗5 次，再用抗兔IgG為二抗孵育1 h后用TBST洗5 次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)上記錄結(jié)果。

1.3.6 熱處理OVA的制備

將純化的OVA蛋白分別置于70、80、90、95 ℃水浴鍋孵育15 min后，立即置于冰上冷卻。采用SDS-PAGE和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA（competitive-ELISA，c-ELISA）分析加熱對(duì)OVA穩(wěn)定性和免疫活性的影響。

1.3.7 c-ELISA法的建立及有效性驗(yàn)證

c-ELISA的建立參考Crowther[20]的方法進(jìn)行。采用棋盤(pán)法對(duì)包被抗原、一抗及二抗的工作濃度進(jìn)行優(yōu)化。以?xún)?yōu)化的抗原濃度進(jìn)行包被，以5%脫脂奶封閉后，加入適當(dāng)稀釋的樣品和等體積的一抗，于37 ℃孵育1.5 h，洗滌后用二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺在37 ℃顯色20 min，加入H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD）值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立是以4 倍稀釋法制備不同質(zhì)量濃度95 ℃熱處理后的OVA做為競(jìng)爭(zhēng)性抗原，進(jìn)行c-ELISA測(cè)定。將各質(zhì)量濃度競(jìng)爭(zhēng)性O(shè)VA的OD值換算成B/B0（B為各質(zhì)量濃度競(jìng)爭(zhēng)性O(shè)VA在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，B0為空白對(duì)照的平均值）。利用OriginPro 9.1.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合及數(shù)據(jù)分析。

方法的重復(fù)性以組內(nèi)誤差和組間誤差進(jìn)行評(píng)價(jià)。組內(nèi)誤差以同一組內(nèi)14 個(gè)重復(fù)樣品的平均變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算；組間誤差以連續(xù)3 d、每天3 個(gè)重復(fù)樣品的平均變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算[21]。檢測(cè)靈敏度根據(jù)公式靈敏度=B0-3s[22]計(jì)算，其中B0為24 個(gè)空白對(duì)照的平均值，s為這24 個(gè)空白對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 魚(yú)丸及魚(yú)糜制品檢測(cè)樣品的制備

魚(yú)丸的制備參考Jiang Taoling等[23]的方法進(jìn)行。取鰱魚(yú)肉，用冰水洗凈，用冰水漂洗魚(yú)肉2 次，將魚(yú)肉3 000×g離心5 min脫水，絞肉后空擂10～15 min后，加入3%食鹽進(jìn)行鹽潰20～30 min。充分擂潰后，分別制成含1、10、100 g/kg蛋清的魚(yú)丸，手工成型后，在90～95 ℃水煮定型，待魚(yú)丸浮起后立即撈出冷卻。

檢測(cè)樣品的制備方法為取100 g魚(yú)丸或商品化魚(yú)糜制品，充分剁碎后，從中取出20 g樣品，加入5 倍體積含0.1 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）的8 mol/L尿素緩沖液，組織搗碎后，4 000×g離心15 min，所得上清液經(jīng)95 ℃熱處理15 min后離心取上清液即為待檢樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗OVA多克隆抗體的制備

圖1 OVA的DEAE-Sepharose離子交換柱層析圖Fig. 1 DEAE-Sepharose chromatography of OVA from egg white

通過(guò)攪拌、離心結(jié)合DEAE-Sepharose離子柱層析技術(shù)從蛋清中純化得到OVA。圖1顯示攪拌、離心后的樣品上樣于DEAE-Sepharose，經(jīng)流洗、洗脫后各收集部分的情況。可以看出，OVA處于吸附部分，在約0.02 mol/L NaCl濃度開(kāi)始洗脫下來(lái)。經(jīng)SDS-PAGE分析（圖1內(nèi)嵌圖），其分子質(zhì)量約為45 ku，與Huntington等[24]報(bào)道的結(jié)果一致。電泳結(jié)果顯示為單一條帶，表明獲得高純度OVA。為進(jìn)一步確定純化的蛋白為OVA，將純化的樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司，利用肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定分析。圖2為獲得的目的蛋白的其中一個(gè)二級(jí)質(zhì)譜圖。如表1所示，共獲得11 個(gè)肽段包含150 個(gè)氨基酸殘基，與已報(bào)道的雞（Gallus gallus）OVA（gi|28566340）的氨基酸序列相似性達(dá)到100%，證實(shí)純化的蛋白為OVA。

圖2 OVA的肽質(zhì)量指紋圖譜Fig. 2 Peptide mass fingerprinting of OVA from egg white

表1 與Gallus gallus OVA比對(duì)的肽段Table 1 Peptide sequences matched to the tryptic peptide mass fingerprint of ovalbumin (Gallus gallus)

2.2 抗OVA多克隆抗體的特異性分析

將純化的OVA加熱處理后，免疫新西蘭雄兔，獲得抗OVA多克隆抗體?？贵w經(jīng)Protein A Sepharose親和層析柱純化后，采用Western blot進(jìn)行特異性分析，結(jié)果如圖3所示。圖3A泳道2含蛋清的魚(yú)丸粗提液中除了45 ku的OVA，還含有許多其他蛋白組分，但只有分子質(zhì)量為45 ku的OVA與制備的抗OVA多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)（圖3B，泳道2），未出現(xiàn)非特異性條帶。不含蛋清的魚(yú)丸粗提液樣品（圖3，泳道1）以及牛血清白蛋白陰性對(duì)照樣（圖3，泳道4）均不與抗體發(fā)生反應(yīng)，表明制備的抗OVA多克隆抗體特異性良好，可用于后續(xù)檢測(cè)方法的建立。

圖3 抗OVA多克隆抗體的特異性分析Fig. 3 Specificity analysis of the anti-OVA polyclonal antibody

2.3 熱處理對(duì)OVA穩(wěn)定性的影響

圖4 熱處理對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抗原IgG結(jié)合能力的影響Fig. 4 Effect of heat treatment on the IgG-binding ability of OVA

在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用未經(jīng)熱處理的OVA作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原進(jìn)行c-ELISA，發(fā)現(xiàn)游離OVA的IgG結(jié)合能力相對(duì)于固相OVA幾乎沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)力。因此，本研究對(duì)純化的OVA進(jìn)行了70～95 ℃不同溫度處理后，通過(guò)c-ELISA法分析熱處理對(duì)OVA IgG結(jié)合能力的影響。研究結(jié)果顯示，加熱不影響OVA的溶解性，且固相抗原的IgG結(jié)合能力幾乎不受熱處理的影響。以250 ng每孔包被未熱處理或熱處理的OVA進(jìn)行間接ELISA分析，最終OD450nm值均為1.5左右，沒(méi)有顯著差異。但在進(jìn)行c-ELISA方法建立時(shí)，熱處理對(duì)OVA的IgG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合能力有顯著影響。如圖4所示，在抗原包被量一致的情況下，隨著加熱溫度的提高，OVA的IgG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合能力顯著上升，這與張銀等[25]的報(bào)道存在差異，這可能與所用的檢測(cè)抗體性質(zhì)不同有關(guān)。本研究制備的抗OVA多克隆抗體目的是應(yīng)用于魚(yú)糜制品的檢測(cè)，在魚(yú)糜制品制備過(guò)程中有加熱處理工藝，是為了更準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)OVA的檢測(cè)。本研究以高溫處理的OVA進(jìn)行動(dòng)物免疫，制備的抗體均能實(shí)現(xiàn)對(duì)未熱處理或熱處理OVA的特異檢測(cè)。進(jìn)一步采用SDS-PAGE對(duì)OVA的熱穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。由圖5可知，OVA的熱穩(wěn)定性良好，95 ℃處理15 min也不發(fā)生降解，但當(dāng)加熱溫度高于80 ℃時(shí)，有少量多聚體產(chǎn)生，這可能與熱處理導(dǎo)致OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)[26]。Azarnia等[27]采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法及ELISA對(duì)意大利面中的OVA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，食物基質(zhì)及熱處理對(duì)檢測(cè)靈敏度及回收率影響較大。結(jié)合圖4的結(jié)果表明，本研究在建立c-ELISA法時(shí)，以95 ℃處理的OVA作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原有利于提高檢測(cè)的靈敏度。

圖5 熱處理對(duì)OVA穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of heat treatment on the stability of OVA

2.4 c-ELISA法的建立

圖6 c-ELISA檢測(cè)OVA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 6 The standard curve of quantification of OVA by c-ELISA method

采用純化的OVA抗原及制備的抗OVA多克隆抗體建立了定量檢測(cè)魚(yú)糜制品中蛋清的c-ELISA方法。經(jīng)過(guò)棋盤(pán)法優(yōu)化，以95 ℃、15 min處理的OVA為抗原，以100 ng/孔進(jìn)行包被。以95 ℃、15 min處理的OVA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，0.032 mg/mL為起始質(zhì)量濃度，以4 倍法稀釋?zhuān)罱K建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖6所示，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，檢測(cè)靈敏度即檢測(cè)限為36.4 ng/mL。若考慮到樣品的最低稀釋倍數(shù)為10，則檢測(cè)限對(duì)應(yīng)為1.82 mg/kg食物，高于Monaci等[28]采用高分辨質(zhì)譜法建立的白酒中OVA等多種過(guò)敏原的檢測(cè)方法。

已有研究[15]表明，蛋清中蛋白約占總質(zhì)量的11%，OVA占蛋清總蛋白的54%左右，因此，在本方法以O(shè)VA為檢測(cè)目標(biāo)對(duì)魚(yú)糜制品中蛋清含量進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，應(yīng)乘以系數(shù)16.8。

2.5 c-ELISA法的驗(yàn)證

通過(guò)計(jì)算同一96 孔板上的14 個(gè)重復(fù)樣的變異系數(shù)，以及連續(xù)3 d、每天3 個(gè)重復(fù)樣的變異系數(shù)分析得到，建立的c-ELISA法的組內(nèi)變異系數(shù)（n=14）為3.1%，組間變異系數(shù)（n=9）為7.8%。以自制的蛋清含量分別為1、10、100 g/kg的魚(yú)丸進(jìn)行c-ELISA法回收率分析。由于熱處理及食物基質(zhì)可能影響到檢測(cè)準(zhǔn)確性[29]，本研究采用含0.1 mmol/L DTT的8 mol/L尿素緩沖液[30]進(jìn)行樣品制備，結(jié)果如表2所示，回收率為87.4%～97.2%，說(shuō)明本研究建立的方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度較高、樣品制備方法適宜，可用于魚(yú)糜制品中蛋清含量的檢測(cè)。

表2 c-ELISA檢測(cè)魚(yú)丸中蛋清的回收率分析Table 3 Recovery of egg white added to fish meatballs by c-ELIS A

2.6 c-ELISA法的應(yīng)用

圖7 商品化魚(yú)糜制品中蛋清的含量Fig. 7 Added egg white content in commercial surimi products

利用建立的方法對(duì)市售6 組魚(yú)糜制品進(jìn)行檢測(cè)，6 組魚(yú)糜制品分別為來(lái)自A公司的爆汁小魚(yú)丸、閩南脆丸、魚(yú)豆腐和B公司的爆汁小魚(yú)丸、閩南脆丸、魚(yú)豆腐。從圖7可以看出，不同魚(yú)糜制品中，蛋清的添加量差異很大，在2.7～83.5 g/kg之間。即使是同一魚(yú)糜制品，不同公司產(chǎn)品的含量差異明顯，表明各公司類(lèi)似產(chǎn)品的配方存在較大差異，這也提示了在魚(yú)糜制品包裝上對(duì)蛋清含量進(jìn)行明確標(biāo)示及監(jiān)管的必要性。

3 結(jié) 論

本研究以蛋清蛋白組分中熱穩(wěn)定性好、含量豐富的OVA為目標(biāo)蛋白，制備抗OVA多克隆抗體，成功建立了魚(yú)糜制品中蛋清含量檢測(cè)的c-ELISA法。該方法檢測(cè)限為1.82 mg/kg食物，組內(nèi)變異系數(shù)為3.1%，組間變異系數(shù)為7.8%，回收率為87.4%～97.2%，具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，并成功應(yīng)用于對(duì)市售魚(yú)糜制品中蛋清含量的檢測(cè)。本研究可為今后魚(yú)糜制品中蛋清的快速檢測(cè)及規(guī)范標(biāo)識(shí)的監(jiān)管提供重要的技術(shù)參考。

[1] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局. 中國(guó)漁業(yè)年鑒[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2015: 212-259.

[2] COWBURN G, STOCKLEY L. Consumer understanding and use of nutrition labelling: a systematic review[J]. Public Health Nutrition, 2005, 8(1): 21-28.

[3] POULSEN L K, HANSEN T K, NORGAARD A, et al. Allergens from fish and egg[J]. Allergy, 2001, 56(S67): 39-42. DOI:10.1034/ j.1398-9995.2001.00912.x.

[4] DHANAPALA P, SILVA C D, DORAN T, et al. Cracking the egg: an insight into egg hypersensitivity[J]. Molecular Immunology, 2015, 66(2): 375-383. DOI:10.1016/j.molimm.2015.04.016.

[5] TONG P, GAO J Y, CHEN H B, et al. Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin[J]. Food Chemistry, 2013, 131(2): 603-610. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.08.084.

[6] MA X J, CHEN H B, GAO J Y, et al. Conformation affects the potential allergenicity of ovalbumin after heating and glycation[J]. Food Additives and Contaminants Part A-Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assessment, 2013, 30(10): 1684-1692. DOI:10.1080 /19440049.2013.822105.

[7] CHANG M L, SHAO B, LIU Y H, et al. Analysis of allergens in 5473 patients with allergic diseases in Harbin, China[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2013, 26(11): 886-893.

[8] DHANAPALA P, SILVA C D, DORAN T, et al. The prevalence of food allergy[J]. Molecular Immunology, 2015, 66(2): 375-383. DOI:10.1016/j.molimm.2015.04.016.

[9] TOLIN S, PASINI G, CURIONI A, et al. Mass spectrometry detection of egg proteins in red wines treated with egg white[J]. Food Control, 2012, 23(1): 87-94. DOI:10.1016/j.foodcont.2011.06.016.

[10] PILOLLI R, VISCONTI A, MONACI L. Rapid and label-free detection of egg allergen traces in wines by surface Plasmon resonance biosensor[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(13): 3787-3797. DOI:10.1007/s00216-015-8607-4.

[11] MATTAROZZI M, MILIOLI M, BIGNARDI C, et al. Investigation of different sample pre-treatment routes for liquid chromatographytandem mass spectrometry detection of caseins and ovalbumin in fortified red wine[J]. Food Control, 2014, 38(1): 82-87.

[12] 田博, 施彤, 王晉, 等. 酶聯(lián)法檢測(cè)流感疫苗中卵清蛋白含量試劑盒的質(zhì)量驗(yàn)證[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2006, 19(6): 647-652. DOI:10.13200/j.cjb.2006.06.100.tianb.032.

[13] LI J T, RANK M A, SQUILLACE D L, et al. Ovalbumin content of influenza vaccines[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, 125(6): 1412-1413. DOI:10.1016/j.jaci.2010.03.009.

[14] FU T J, MAKS N, BANASZEWSKI K. Effect of heat treatment on the quantitative detection of egg protein residues by commercial enzymelinked immunosorbent assay test kits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(8): 4831-4838.

[15] ABEYRATHNE E D, LEE H Y, AHN D U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pahrmaceutical agents: a review[J]. Poultry Science, 2013, 92(12): 3292-3299. DOI:10.3382/ps.2013-03391.

[16] BLOOM K A, HUANG F R, BENCHARITIWONG R, et al. Effect of heat treatment on milk and egg proteins allergenicity[J]. Pediatric Allergy and Immunology Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology, 2014, 25(8): 740-746.

[17] TANKRATHOK A, DADUANG S, PATRAMANON R, et al. Purification process for the preparation and characterizations of hen egg white ovalbumin, lysozyme, ovotransferrin, and ovomucoid[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2009, 39(4): 380-399. DOI:10.1080/10826060903209646.

[18] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685. DOI:10.1038/227680a0.

[19] TOWBIN H, STAEHELIN T, GORDON J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1979, 76(9): 4350-4354. DOI:10.1073/pnas.76.9.4350.

[20] CROWTHER J R. The ELISA Guidebook[M]. Totowa, NJ: Humana Press Inc, 2001: 83-112.

[21] CAI Q F, WANG X C, LIU G M, et al. Development of a monoclonal antibody-based competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA) for quantification of silver carp parvalbumin[J]. Food Control, 2013, 29(1): 241-247. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.06.016.

[22] HUSAIN F T, BRETBACHER I E, NEMES A, et al. Development and validation of an indirect competitive enzyme linked-immunosorbent assay for the determination of potentially allergenic sesame (Sesamum indicum) in food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(3): 1434-1441. DOI:10.1021/jf903350h.

[23] JIANG T L, CAI Q F, SHEN J D, et al. Establishment of immunological methods for the detection of soybean proteins in surimi products[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64(1): 344-349. DOI:10.1016/j.lwt.2015.06.005.

[24] HUNTINGTON J A, STEIN P E. Structure and properties of ovalbumin[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 2001, 756(1/2): 189-198. DOI:10.1016/S0378-4347(01)00108-6.

[25] 張銀, 佟平, 麻小娟, 等. 熱加工及超高壓處理對(duì)卵白蛋白抗原性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 250-253.

[26] GOLIAS J, SCHWARZER M, WALLNER M, et al. Heat-induced structural changes affect OVA-antigen processing and reduce allergic response in mouse model of food allergy[J]. PloS ONE, 2012, 7(5): e37156. DOI:10.1371/journal.pone.0037156.

[27] AZARNIA S, BOyE J I, MONGEON V, et al. Detection of ovalbumin in egg white, whole egg and incurred pasta using LC-ESI-MS/MS and ELISA[J]. Food Research International, 2013, 52(2): 526-534. DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.039.

[28] MONACI L, LOSITO I, de ANGELIS E, et al. Multi-allergen quantification of fining-related egg and milk proteins in white by highresolution mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2013, 27(17): 2009-2018. DOI:10.1002/rcm.6662.

[29] AZAMIA S, BOyE J I, MONGEON V, et al. Detection of ovalbumin in egg white, whole egg and incurred pasta using LC-ESI-MS/MS and ELISA[J]. Food Research International, 2013, 52(1): 526-534. DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.039.

[30] 江韜玲, 沈建東, 蔡秋鳳, 等. 熒光法檢測(cè)魚(yú)糜制品中大豆蛋白的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(14): 54-62. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.14.043.

Quantification of Added Egg White in Surimi Products by Competitive Enzyme Linked-Immunosorbent Assay

ZHAO Yongjuan1, WENG Ling1,2, YAN Longjie1, LIU Mengqi1, ZHANG Lingjing1,2, CAO Minjie1,2,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. National & Local Joint Engineering Research Center of Deep Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China)

In this study, a competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA) using the polyclonal antibody against purified ovalbumin (OVA), the major protein in egg white, was proposed to quantify added egg white in surimi products. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot results showed the high specificity of the anti-OVA polyclonal antibody. The limit of detection (LOD) of the c-ELISA method was 1.82 mg/kg, and the intra- and inter-assay coefficients of variation were 3.1% and 7.8%, respectively. Recovery rates of egg white added to fish meatballs ranged from 87.4% to 97.2%. The c-ELISA method was successfully applied to quantify added egg white in commercial surimi products, and results demonstrated that the added egg white content was 2.7–83.5 g/kg in six samples from different manufacturers. Our results indicated that the method established can be applied to quantify added egg white in surimi products.

egg white; ovalbumin; surimi products; competitive enzyme linked-immunosorbent assay (c-ELISA)

10.7506/spkx1002-6630-201714044

TS254

A

1002-6630（2017）14-0284-06

趙勇娟, 翁凌, 顏龍杰, 等. 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)魚(yú)糜制品中蛋清含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 284-289.

10.7506/ spkx1002-6630-201714044. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yongjuan, WENG Ling, YAN Longjie, et al. Quantification of added egg white in surimi products by competitive enzyme linked-immunosorbent assay[J]. Food Science, 2017, 38(14): 284-289. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714044. http://www.spkx.net.cn

2016-08-09

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31271838）；福建省重大科研專(zhuān)項(xiàng)（2011NZ0002-1）

趙勇娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：1217248231@qq.com

*通信作者：曹敏杰（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品深加工、蛋白質(zhì)化學(xué)。E-mail：mjcao@jmu.edu.cn