張家寧，丁 軻*，韓 濤，陳湘寧

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

不同凈化柱處理對小麥粉中4 種鐮刀菌毒素的凈化效果

張家寧，丁 軻*，韓 濤，陳湘寧

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

比較MycoSep?226多功能凈化柱、DZT MS-PREP免疫親和柱和實(shí)驗(yàn)室制備聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱在檢測小麥粉中4 種鐮刀菌毒素（玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素）過程中的前處理效果。選擇MycoSep?226多功能凈化柱、DZT MS-PREP免疫親和柱和實(shí)驗(yàn)室制備聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱，通過不同的提取和前處理方法，以及建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，對小麥粉中的4 種鐮刀菌毒素進(jìn)行測定。DZT MS-PREP免疫親和柱處理小麥粉樣品所得的回收率為88.01%～107.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～14.42%；聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱的回收率為70.05%～112.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.42%～12.25%；MycoSep?226多功能凈化柱的回收率為69.42%～111.12%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～13.24%。免疫親和柱具有重復(fù)利用，有機(jī)溶劑耗用量少、特異性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢，且聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱為新載體免疫親和柱的制備提供了依據(jù)。

鐮刀菌毒素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；MycoSep?226多功能凈化柱；聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱；DZT MS-PREP免疫親和柱

引文格式：張家寧, 丁軻, 韓濤, 等. 不同凈化柱處理對小麥粉中4 種鐮刀菌毒素的凈化效果[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 316-322.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714049. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Jianing, DING Ke, HAN Tao, et al. Purification efficiency of four Fusarium toxins from wheat flour with different purification columns[J]. Food Science, 2017, 38(14): 316-322. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714049. http://www.spkx.net.cn

鐮刀菌毒素是鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱[1]，廣泛存在于各種糧食作物（如小麥、玉米等）及其加工制品中，多見于潮濕環(huán)境中儲(chǔ)藏的發(fā)霉糧食中[2]。其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、T-2毒素和HT-2毒素等[3-7]4 類真菌毒素是造成小麥粉污染的主要真菌毒素。對于鐮刀菌毒素的檢測方法主要有氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、高效液相色譜法[11-12]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]。考慮到小麥粉基質(zhì)的復(fù)雜性及鐮刀菌毒素在樣品中含量較低的特點(diǎn)，以上這些檢測方法[15-16]通常會(huì)結(jié)合一種前處理方法，如固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）技術(shù)[17-25]。

目前國內(nèi)外研究中，多功能凈化柱和免疫親和柱在糧食及其制品中鐮刀菌毒素的前處理過程中的應(yīng)用較為廣泛[26-31]。對于鐮刀菌毒素的前處理，多功能凈化柱以MycoSep?226最常見。免疫親和柱常用的介質(zhì)載體包括無機(jī)載體、多糖和高分子聚合物[27]。無機(jī)載體具有粒度均勻、機(jī)械強(qiáng)度高等特點(diǎn)，但適用范圍比較窄，且表面的非特異性吸附也使得它在生物活性產(chǎn)品分離、分析中的應(yīng)用受到限制。多糖類載體生物相容性好、親水性強(qiáng)，是最常用的吸附與分離載體，且市售已有針對以上4 種鐮刀菌毒素的多糖類載體的商品免疫親和柱。但是多糖類載體價(jià)格昂貴、機(jī)械強(qiáng)度差，用這類載體填裝的層析柱不能耐受高壓和高流速。合成的高分子聚合物載體具有好的機(jī)械強(qiáng)度和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，而且價(jià)格相對低廉，是很有前景的層析載體，但作為免疫親和柱填充介質(zhì)的研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)選擇MycoSep?226多功能凈化柱、DZT MS-PREP免疫親和柱和實(shí)驗(yàn)室制備聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱，建立不同前處理方式，比較其回收率和柱效等，旨在選擇出多種鐮刀菌毒素前處理的較優(yōu)方法，擬為解決快速準(zhǔn)確檢測食品中多種鐮刀菌毒素含量的問題提供方法借鑒，也為有關(guān)研究的進(jìn)一步開展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從北京、天津、河北、河南、山東、遼寧6 個(gè)省市的超市、農(nóng)貿(mào)市場，購買7 種不同品牌不同產(chǎn)地的小麥粉定型包裝樣品。

DON（CAS 51481-10-8）、ZEN（CAS 17924-92-4）、T-2（CAS 21259-20-1）、HT-2（CAS 26934-87-2）毒素標(biāo)準(zhǔn)品（購自新加坡Pribolab公司），均用甲醇溶解并定容至質(zhì)量濃度100 μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃條件下避光保存；10 mmol/L乙酸銨溶液（分析純）；0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；0.1 mol/L NaAc（pH 4.0，含0.5 mol/L NaCl）；0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0，含0.5 mol/L NaCl）；0.01 mol/L PBS（pH 7.4，含0.01% NaN3）。

1.2 儀器與設(shè)備

1200-ESI6410液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；MycoSep?226多功能凈化柱 新加坡Pribolab公司；DZT MS-PREP免疫親和柱 德國R-Biopharm公司；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x 北京八方世紀(jì)有限公司；聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱由農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；SUPER SERIES超純水系統(tǒng) 美國Aquapro公司。

1.3 方法

1.3.1 聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱的制備

1.3.1.1 硝基聚苯乙烯-二乙烯苯微球的制備

配制10 g/100 mL的聚苯乙烯-二乙烯苯微球乳液，50 ℃水浴中高速攪拌下，加入比例為3∶2的硫酸與硝酸的混合，反應(yīng)2 h。將反應(yīng)混合物注入去離子水中，過濾，去離子水洗滌至濾除產(chǎn)物的pH值呈中性，37 ℃真空干燥24 h，得到淡黃色粉末。

1.3.1.2 氨基聚苯乙烯-二乙烯苯微球的制備

取3.0 g硝基聚苯乙烯-二乙烯苯微球于燒瓶中，75 ℃水浴中高速攪拌，加入2 mol/L KOH溶液180 mL和12 g還原劑Na2S2O4，反應(yīng)4 h。將反應(yīng)混合物過濾，去離子水洗滌至中性，37 ℃真空干燥24 h，得到黃色粉末。

1.3.1.3 氨基聚苯乙烯-二乙烯苯微球的活化

取3.0 g氨基化聚苯乙烯-二乙烯苯微球，用8 mL pH 7.0 的 PBS分散，超聲30 min。加入32 mL 25%戊二醛溶液，在29 ℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應(yīng)（200 r/min）3 h，停止活化。用pH 5.0 的0.2 mol/L的PBS清洗3 遍，最終將活化后的樹脂材料溶解在5 mL，pH 5.0的此PBS中，得到0.3 g/mL的樹脂溶液。

1.3.1.4 氨基聚苯乙烯-二乙烯苯微球偶聯(lián)抗體

取DON抗體1.25 mg，T-2/HT-2抗體0.2 mg，ZEA抗體0.3 mg，將上述抗體加入50% PBS-甘油溶液（PBS、甘油各250 μL），再取上述活化過的樹脂材料1 mL（約0.3 g），將兩者混合，25 ℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應(yīng)12 h。離心取上清液用考馬斯亮藍(lán)法計(jì)算偶聯(lián)率。將混合溶液裝入2.5 mL的SPE空柱管，制成免疫親和柱。

1.3.2 樣品前處理

MycoSep?226多功能凈化柱：稱取小麥粉樣品25.0 g （精確至0.1 g）于500 mL具塞錐形瓶中, 加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V）提取液，浸泡15 min，超聲振蕩40 min，過濾，取8 mL 濾液，過MycoSep?226多功能柱，取過柱后液體4 mL，氮?dú)獯蹈桑状既芤憾ㄈ葜? mL。

DZT MS-PREP免疫親和柱和聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱：稱取小麥粉樣品25.0 g（精確至0.1 g）于500 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL 70%甲醇溶液（V/V），浸泡15 min，超聲振蕩40 min，過濾，取16mL 濾液，以2 mL/min的速率過柱，再用16 mL水以5 mL/min的速度洗滌免疫親和柱；用1 mL 100%甲醇溶液以1 滴/s的速度洗脫柱子，將洗脫液收集于2 mL的樣液瓶中，再用1 mL水以5 mL/min的速率洗滌免疫親和柱，同樣收集于上述樣液瓶中。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

離子源：ESI源（300 ℃），霧化氣壓力1.03×105Pa。色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP柱（50 mm×2.1 mm，3.5 ?m），柱溫20 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相：乙酸銨溶液（A）-乙腈溶液（B）體系，流速為0.3 mL/min。梯度條件：0～0.1 min，B 10%；0.1～2 min，B 10%～50%；2～10 min，B 50%～80%；10～15 min，B 80%；15～16 min，B 80%～10%；16～20 min，B 10%。電離模式、監(jiān)測離子對（m/z）和其他參數(shù)見表1。

表1 4 種鐮刀菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Instrumental settings for analysis of the four Fusarium toxins

1.3.4 定量分析

將配制的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以峰面積（Y）對相應(yīng)真菌毒素質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。

準(zhǔn)確稱取若干份相同的小麥粉樣品各25 g，分別減少加入4 種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，按1.3.1節(jié)所述步驟處理后檢測。儀器信噪比為3∶1時(shí)，單離子檢測掃描中選擇離子不再有峰出現(xiàn)，此時(shí)小麥粉中4 種真菌毒素的質(zhì)量濃度即為方法的檢出限；再根據(jù)儀器信噪比為10∶1時(shí)計(jì)算定量限。

1.3.5 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取若干份相同的小麥粉樣品各25 g，向小麥粉中加入等量的不同質(zhì)量濃度的4 種真菌毒素標(biāo)樣，混勻，靜置0.5 h。按1.3.1節(jié)所述步驟，分別用3 種前處理方式進(jìn)行凈化。同時(shí)對空白小麥粉樣品進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品做3 份平行。計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（精密度）。

1.3.6 免疫親和柱再生性和穩(wěn)定性

MycoSep?226多功能凈化柱不能重復(fù)使用。因此，僅對DZT MS-PREP免疫親和柱和實(shí)驗(yàn)室制備聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱進(jìn)行再生性處理。分別用0.1 mol/L NaAc（pH 4.0，含0.5 mol/L NaCl）和0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0，含0.5 mol/L NaCl）交替沖洗柱子至少3 個(gè)循環(huán)，再用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）沖洗，最后，用含0.01% NaN30.01 mol/L PBS（pH 7.4）封閉柱子進(jìn)行保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量分析結(jié)果

圖1 4 種鐮刀菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of mixed standard solution of four Fusarium toxins

如圖1所示，4 種真菌毒素HT-2、T-2、DON和ZEN的保留時(shí)間分別為5.34、6.11、7.67 min和7.68 min。表2表明：4 種鐮刀菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.995以上，檢出限為2～5 ?g/L。

表2 4 種鐮刀菌毒素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, detection limits and quantitation limits of four Fusarium toxins

2.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 3 種不同前處理柱的添加回收率比較Fig. 2 Comparison of recoveries from spiked samples with three different columns

DZT MS-PREP免疫親和柱的回收率為88.01%～107.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～14.42%。聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱的回收率為70.05%～112.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.42%～12.25%。MycoSep?226多功能凈化柱的回收率為69.42%～111.12%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～13.24%。如圖2所示，總體上，DZT MS-PREP免疫親和柱的回收率接近100%，聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱與MycoSep?226多功能凈化柱與之相比較低。由于抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，免疫親和柱具有很高的靈敏度和選擇性，實(shí)驗(yàn)室制備聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱較商品材質(zhì)免疫親和柱雖較低，但卻整體高于MycoSep?226多功能凈化柱，為新載體免疫親和柱的制備提供了依據(jù)。

2.3 小麥粉樣品的檢出結(jié)果

圖3 處理7 種小麥粉樣品的結(jié)果Fig. 3 Contents of Fusarium toxins in 7 flour samples separated usingthree different columns

如圖3所示，用MycoSep?226多功能凈化柱處理的樣品，DON、HT-2、T-2的檢出率為100%，1、3、4、5號(hào)樣品ZEN的檢出率為100%；而聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱和DZT MS-PREP免疫親和柱處理的樣品，4 種鐮刀菌毒素的檢出率均為100%。對于3 種前處理柱處理后1～7號(hào)小麥粉樣品中4 種鐮刀菌毒素的檢測結(jié)果均保持一致，但DZT MS-PREP免疫親和柱所得檢出值相對較高。免疫親和柱比MycoSep?226多功能凈化柱更能夠有效去除基質(zhì)干擾，因此表現(xiàn)出較高的靈敏度。

GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中對小麥、玉米、大麥中DON和ZEN限量做了規(guī)定，分別為1 000 ?g/kg和60 ?g/kg。由檢測結(jié)果可知，3、4號(hào)樣品ZEN值均超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)。但我國目前未有HT-2、T-2相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 免疫親和柱的再生性和穩(wěn)定性

圖4 DZT MS-PREP免疫親和柱使用3 次的回收率Fig. 4 Recoveries of Fusarium toxins with DZT MS-PREP when it was repeatedly used for three times

如圖4、5所示，4 種鐮刀菌毒素的回收率均有一定程度的降低，但下降不明顯，具有一定的穩(wěn)定性。免疫親和柱的再生性和穩(wěn)定性，大大節(jié)約了成本，提高了使用效率，相較于MycoSep?226多功能凈化柱一次性使用具有很大的優(yōu)勢。

圖5 聚苯乙烯-二乙烯苯免疫親和柱使用3 次的回收率Fig. 5 Recoveries of Fusarium toxins with PS-DVB when it was repeatedly used for three times

3 討 論

DON引起急性中毒的癥狀包括惡心、嘔吐、頭暈頭痛和腹瀉，其慢性毒性主要表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的攝食減少、生長緩慢及血清免疫球蛋白水平改變。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在其第56次會(huì)議制定了暫定最大每日可耐受攝入量為1 000 ng/kg。ZEN具有雌激素作用，主要作用于生殖系統(tǒng)，并具有免疫毒性、細(xì)胞毒性和肝毒性，對腫瘤發(fā)生也有一定影響。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)在其第53次會(huì)議上制定了ZEN的暫定每日最大容許攝入量為500 ng/kg。T-2、HT-2毒素主要作用于細(xì)胞分裂旺盛的組織器官，抑制這些器官細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA合成。此外，可引起淋巴細(xì)胞中DNA單鏈的斷裂。T-2毒素還可作用于氧化磷酸化的多個(gè)部位而引起線粒體呼吸抑制。

國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測2010—2015年，在全國范圍監(jiān)測了小麥及小麥粉中的DON、ZEN，其中DON超標(biāo)率為0.47%～20.70%，均值范圍148～782 μg/kg ZEN超標(biāo)率為0.06%～7.65%，均值范圍2.60～76.6 μg/kg。與本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采集的7 份小麥粉樣本檢測結(jié)果相符。但是目前尚未監(jiān)測過小麥及小麥粉中的T-2毒素和HT-2毒素。

本實(shí)驗(yàn)提供的檢測方法，可以同時(shí)檢測4 種鐮刀菌毒素，簡化了操作步驟。DZT MS-PREP免疫親和柱的回收率為88.01%～107.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.09%～14.42%；聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱的回收率為70.05%～112.80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.42%～12.25%。有較高的靈敏度和特異性，具有重復(fù)利用，有機(jī)溶劑耗用量少等顯著優(yōu)勢。聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂免疫親和柱以高分子合成材料為新的載體，突破了傳統(tǒng)免疫親和柱以多糖類為載體、價(jià)格昂貴、機(jī)械強(qiáng)度差的缺點(diǎn)，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，pH值適用范圍寬，以樹脂材料為載體的免疫親和柱為新載體免疫親和柱的制備提供了依據(jù)。

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Purification Efficiency of Four Fusarium Toxins from Wheat Flour with Different Purification Columns

ZHANG Jianing, DING Ke*, HAN Tao, CHEN Xiangning
(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Food Science and Engineering College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

A method for the simultaneous determination of four Fusarium toxins in wheat flour including zenralenone, deoxynivalenol, T-2 and HT-2 toxins was established using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Samples were cleaned up with a MycoSep?226 multifunctional column, a DZT MS-PREP immunoaffinity column, which were both commercial products, and a polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) immunoaffinity column which was prepared in our laboratory, respectively. The recoveries of Fusarium toxins purified with MycoSep?226 ranged from 69.42% to 111.12% with relative standard deviations (RSDs) of 1.46%–13.24%, those obtained with PS-DVB ranged from 70.05% to 112.80% with RSDs of 3.42%–12.25%, and those obtained with DZT MS-PREP ranged from 88.01% to 107.31% with RSDs of 1.09%–14.42%. Immunoaffinity columns had the advantages of repeated use, less organic solvent consumption and high specificity. Moreover, PS-DVB could be a promising new immunoaffinity carrier.

Fusarium toxins; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); MycoSep?226 multifunctional column; polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) immunoaffinity column; DZT MS-PREP immunoaffinity column

10.7506/spkx1002-6630-201714049

TS201.6

A

1002-6630（2017）14-0316-07

2016-08-09

北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD20154045）；

北京市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201710020014）；北京農(nóng)學(xué)院食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室2017年度開放課題；

張家寧（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測技術(shù)。E-mail：s631852@163.com

*通信作者：丁軻（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：dingk@tom.com