崔 青，錢炳俊，姚曉敏，季順利，魯飛鳳，吳 靜，張建華*

（上海交通大學農業(yè)與生物學院，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

納豆激酶基因工程菌的構建及酶活力分析

崔 青，錢炳俊，姚曉敏，季順利，魯飛鳳，吳 靜，張建華*

（上海交通大學農業(yè)與生物學院，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

納豆激酶由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）的aprN基因編碼，在體內外具有很強的溶解纖維蛋白活性。利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術擴增B. subtilis natto的aprN基因，并依據B. subtilis的密碼子偏好性優(yōu)化了起始30 個氨基酸的密碼子，構建了重組表達質粒pHT01-aprN。經限制性酶酶切、PCR擴增和測序驗證了其編碼的正確性。通過電擊法將含有強啟動子的pHT01-aprN導入B. subtilis，利用氯霉素抗性篩選獲得B.s 168/pHT01-aprN工程菌。經IPTG誘導表達，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最高酶活力為（289.00±3.42） U/mL，是野生菌的3.9 倍，酶活力表達穩(wěn)定性良好。

納豆激酶；aprN基因；枯草芽孢桿菌；基因工程菌；酶活力

納豆是利用納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵黃豆制成的豆制品，是日本的一種傳統(tǒng)食品，因其含有的納豆激酶（nattokinase，NK）具有抗血栓作用深受人們喜愛，已發(fā)展為保健食品。NK是由B. subtilis natto產生的一種絲氨酸蛋白酶[1]，除在體內外有強烈的纖維蛋白溶解活性外，還有促進血液流動、防血小板凝聚和降血壓等功效[2-3]。1980年，須見洋行博士首次發(fā)現(xiàn)NK[4]，其分子質量為27 kD，等電點為8.6±0.3。血栓是引起的心血管疾病的風險因子之一，嚴重危害人類健康[5-6]。目前，溶栓劑包括注射類降解藥物（尿激酶、鏈激酶和組織型纖維蛋白原激活劑）和口服類的類組織纖維蛋白酶的蛋白（NK和蚓激酶[7]）兩大類。注射類降解藥物高度依賴體內組織纖維蛋白酶原的水平，存在一定毒性，半衰期短且成本高；而NK屬于天然發(fā)酵產物，安全性高，具有體內效應時間長、價格低廉、有預防作用及易于規(guī)?；a等優(yōu)點，其臨床應用已得到美國食品藥品監(jiān)督管理局認可。

提高NK工業(yè)化生產對治療血栓疾病有重要意義。采用優(yōu)化啟動子和信號肽、選用蛋白酶缺失的菌株以降低NK降解或者直接改造NK基因序列等技術手段可以達到提高NK產量的目的[8-15]。例如Wu Shuming等[8]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為宿主菌構建了NK基因工程菌，實現(xiàn)了其可溶性表達并通過優(yōu)化啟動子使其酶活力增加了136%。其他細菌，例如大腸桿菌（Escherichia coli）[9-10]、地衣芽孢桿菌[11]、乳酸鏈球菌[12]和酵母菌[13]等也被作為宿主菌通過基因工程發(fā)酵生產NK[14]。但這些技術也存在一些需要解決的問題，如在E. coli中表達出沒有活性的包涵體；在其他工程菌中NK雖然能夠可溶性表達，但酶產量低[15-17]，純化回收過程復雜[18]，因此工程菌的構建策略有待進一步優(yōu)化，選擇合適宿主菌株和采用恰當?shù)幕蚬こ淌侄螛嫿óaNK基因工程菌株成為研究了熱點。

Nishito等[19]已經證明，B. subtilis natto屬于B. subtilis的一個亞種。B. subtilis無致病性、具備包含轉錄、翻譯、蛋白質折疊和分泌等機制，常常作為工程菌株構建載體。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)B. subtilis 168含有NK基因序列，但不能表達有活性的NK。基于E. coli-B. subtilis穿梭質粒的表達載體pHT01可以在B. subtilis中高效表達重組外源蛋白。但每種生物都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛，如E. coli、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質的基因明顯避免低利用率的密碼子[20]。因此，重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響。本研究采用分子生物學方法，依據B. subtilis的基因密碼子偏好性，優(yōu)化aprN基因編碼前30 個氨基酸的序列，以pHT01為表達載體，成功構建B.s 168/pHT01-aprN，經搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最高酶活力可達（289.00±3.42）U/mL，酶活力表達穩(wěn)定性良好。NK中加入6 個組氨酸標記，可采用鎳柱親和層析進行純化。本實驗為NK基因工程進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

B. subtilis 168菌株為江南大學陳衛(wèi)教授惠贈；B. subtilis natto和E. coli DH5α為本實驗室保藏；pMD19-T Simple載體 大連TaKaRa公司；pHT01 美國Invitrogen公司。

1.1.2 試劑

限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ和SmaⅠ大連TaKaRa公司；氯霉素、氨芐卡那霉素、蛋白胨、酵母提取物、山梨醇、甘露醇、海藻糖 英國Oxoid公司；D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺 上海鼓臣生物技術有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基A：葡萄糖10 g/L、酵母提取物10 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、1%甘油、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L，pH 7.0～8.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基B：葡萄糖20 g/L、酵母提取物20 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、2%甘油、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L，pH 7.0～8.0。

1.1.4 引物的設計與合成

根據GenBank上收錄NK基因序列（GI：608796180），依據宿主菌B. subtitle 168密碼子偏好性（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi?species=1423），利用生物軟件Oligo設計引物（表1），擴增aprN基因并優(yōu)化它的前30個氨基酸密碼子。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers used for PCR amplification

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、微量臺式離心機 德國Eppendrof公司；電轉儀英國Biochrom公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 擴增與優(yōu)化aprN基因

將保藏的B. subtilis 168菌株活化后，按照2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。目的基因的克隆采用重疊PCR的方法[21]，即以菌液為第1次PCR擴增模版，將凝膠電泳驗證后的膠回收產物作為第2次PCR擴增模版，再以此次膠回收產物為模版進行第3次PCR擴增。引物依次為F1-R1、F2-R1和F3-R2His，擴增并優(yōu)化源于B. subtilis natto的aprN基因。

1.3.2 目的基因克隆和測序

試劑盒回收并純化第3次PCR擴增產物，產物通過TA克隆連到質粒pMD19-T。pMD19-T載體連接體系（10 μL）：DNA 4.5 μL、pMD19-T 0.5 μL、緩沖溶液Ⅰ5 μL，4 ℃過夜連接。通過熱激轉化方法將連接產物導入E. coli感受態(tài)中，涂布Amp抗性平板（終質量濃度100 μg/mL）。提取陽性克隆菌落質粒DNA，通過限制性內切酶酶切圖譜分析和PCR產物測序驗證，將攜帶pMD19-T∶aprN的質粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。

1.3.3 表達載體的構建及驗證

用限制性內切酶EcoRⅤ和BamHⅠ酶切pMD19-T∶aprN，切下的aprN基因片段插入pHT01的SmaⅠ和BamHⅠ酶切位點之間（多克隆位點位于啟動子和終止子之間），其中EcoRⅤ和SmaⅠ均為平末端酶，經T4連接酶可以識別并連接。通過熱激轉化方法將連接產物導入E. coli感受態(tài)中，涂布Amp抗性平板（終質量濃度100 μg/mL）篩選轉化子。提取陽性克隆菌落質粒DNA，通過限制性內切酶酶切圖譜分析和PCR產物測序驗證后，將攜帶pHT01：aprN的質粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。1.3.4 B.s 168/pHT01-aprN的構建及鑒定

B. subtilis 168的感受態(tài)細胞制備和電擊轉化均參考Xue Gangping[22]的方法。隨機挑取氯霉素抗性平板上長出的單菌落，提取質粒DNA，PCR產物測序驗證，將攜帶pHT01-aprN的質粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)

取甘油管中B.s 168/pHT01-aprN、B. subtilis natto野生菌和B. subtilis168宿主菌分別以2%接種量接種于LB培養(yǎng)基（含5 μg/mL氯霉素）中，200 r/min、37 ℃過夜培養(yǎng)。以2%接種量將B.s 168/pHT01-aprN種子液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基A（含5 μg/mL氯霉素）中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，至OD600nm在0.8～1.0之間，降溫至25 ℃，接入終濃度為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）。對照組以2%接種量分別將B. subtilis natto野生菌和B. subtilis 168宿主菌種子液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基A中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。在不同發(fā)酵時間同時取3 種菌液測定OD600nm和NK酶活力。

1.3.6 NK活力測定

NK活力分析采用四肽底物法[23]。首先制作對硝基苯胺的標準曲線：配制對硝基苯胺樣品溶液，濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mmol/L，在405 nm波長處測定不同濃度硝基苯胺樣品溶液的OD值，以水作為空白對照。取發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心1 min，將上清液稀釋成不同濃度作為檢測樣品液。檢測方法在文獻[24]基礎上加以改進：取100 μL發(fā)酵上清液稀釋一定倍數(shù)與50 μL終濃度為0.5 mmol/L的四肽底物（D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺）混合并在37 ℃水浴下反應1 min，加入75 μL 50%冰醋酸溶液終止反應，在405 nm波長處測定反應液OD值。NK活力單位被定義為每分鐘釋放1 nmol對硝基苯胺的NK含量。實驗重復3 次，每次3 個平行。

1.3.7 酶活力的影響因素分析

探究2,6-吡啶二羧酸、IPTG、誘導溫度、接種量對酶活力的影響，以培養(yǎng)基A為發(fā)酵培養(yǎng)基，2,6-吡啶二羧酸濃度設置為0.5、1.0、2.0 mmol/L；IPTG濃度設置為：0.2、0.5、1.0 mmol/L；誘導溫度設置為25、30、37 ℃；接種量設置為1%、2.5%、5%和7.5%。為提高NK酶活力，確定培養(yǎng)基成分后再將碳源、氮源和無機鹽濃度提高1 倍。以B. subtilis natto野生菌和宿主菌B. subtilis168作對照。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

數(shù)據處理采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用鄧肯氏多重（Duncan’s multiple range test）比較分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 aprN基因的克隆和表達載體構建

2.1.1 aprN基因的克隆

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物Fig. 1 Identification of PCR products by agarose gel electrophoresis

利用設計的引物依次進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定第3次PCR產物，在1 100 bp附近有十分明顯的DNA擴增帶，與預期aprN基因長度1 125 bp吻合（圖1）。PCR產物序列結果與NCBI上序列對比，同源性達99%。

圖 2aprN基因前30 個氨基酸密碼子優(yōu)化前后的序列比對Fig. 2 Sequence comparison of the codons encoding the first 30 amino acids of aprN gene before and after optimization

重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響，為提高B. subtilis 168中NK的翻譯速率，依據B. subtilis的密碼子偏好性，優(yōu)化了NK前30 個氨基酸密碼子，密碼子優(yōu)化前后的序列如圖2所示。經限制性內切酶EcoRⅤ和BamHⅠ雙酶切，鑒定插入片段與預期一致，如圖3所示，1 100 bp左右的條帶是目的基因aprN，克隆載體構建成功。

圖3 pMD19-T:aprN經EcoR Ⅴ/BamHⅠ酶切電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of plasmid pMD19-T:aprN digested by EcoR Ⅴ and BamH Ⅰ

2.1.2 pHT01-aprN重組質粒構建

圖4 pHT01-aprN重組質粒圖Fig. 4 Schematic diagram of pHT01-aprN

pHT01可在細胞質中高水平表達重組蛋白，其攜帶的啟動子是基于強σA-依賴性啟動子的B. subtilis groE操縱子，通過添加乳糖操縱子改造而成的一種高效可控的（IPTG誘導的）啟動子。該載體還插入了一個高效SD序列以及一個多克隆位點（BamHⅠ、XbaⅠ、AatⅡ、SmaⅠ）。aprN基因信號肽編碼區(qū)域與SD序列融合以此獲得分泌的重組蛋白。本實驗嘗試采用pHT01載體構建表達質粒，有望提高NK在B. subtilis 168中翻譯速率并實現(xiàn)胞外表達。

經限制性內切酶EcoRⅤ/BamHⅠ從pMD19-T:aprN切下的aprN基因片段插入pHT01的多克隆酶切位點BamHⅠ和SmaⅠ之間，構建重組質粒pHT01-aprN，如圖4所示。

由圖4可知，pHT01-aprN重組質粒的啟動區(qū)域包含groE啟動子（gra）、lacO操縱子和RBS序列，阻遏蛋白LacI與LacO結合阻遏轉錄起始，乳糖的類似物IPTG可以和LacI產物結合，使其構象改變離開LacO，從而激活轉錄。插aprN基因長1 125 bp，該質粒含有氯霉素表達區(qū)域，可以氯霉素作為重組質粒篩選標記。BamHⅠ和HindⅢ酶切位點用于后續(xù)鑒定。

圖5 pHT01-aprN經BamHⅠ/HindⅢ酶切電泳圖Fig. 5 Electrophoretogram of plasmid pHT01-aprN digested by BamHⅠand HindⅢ

pHT01-aprN經限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切后，切得條帶分別為491、1 101、2 027 bp（圖5A）；圖5B顯示pHT01質粒經相同酶切后，切得條帶分別為473 bp和2 027 bp。切得條帶大小與預期結果一致（圖4），表明圖5A-2泳道的轉化子應為陽性克隆，該菌株中的質粒pHT01上已成功插入aprN基因片段，攜帶pHT01-aprN重組質粒的基因工程菌B.s 168/pHT01-aprN構建成功。

2.1.3 B.s 168/pHT01-aprN工程菌鑒定

在所有革蘭氏陽性菌中，B. subtilis載體因下列原因尤為引人矚目[24]：1）一般認為是安全的有機體；2）可胞外分泌蛋白；3）具備包含轉錄、翻譯、蛋白質折疊和分泌機制，可對其進行遺傳操作和大規(guī)模發(fā)酵；4）細胞壁的組成簡單，只含有肽聚糖和磷壁酸，因此在分泌的蛋白質產品中不會混雜有胞被內毒素。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性菌落PCR擴增產物Fig. 6 Identification of PCR products by agarose gel electrophoresis

pHT01-aprN重組質粒電轉入B. subtilis 168，陽性菌落PCR擴增圖譜如圖6所示，在1 100 bp附近有明顯的特異性擴增條帶，與目的基因相符，經測序驗證正確，證明攜帶pHT01-aprN重組質粒的工程菌B.s 168/pHT01-aprN構建成功。

2.2 NK酶活力影響因素分析

2.2.1 酶活力測定標準曲線

圖7 NK活力檢測標準曲線Fig. 7 Standard curve for NK activity measurement

四肽底物法是測定NK酶活力的常用方法之一，主要是考察NK水解酰胺鍵的能力檢測酶活力，具有檢測快速、方便、靈敏度高的特點。NK活力檢測標準曲線如圖7所示，其回歸方程為y=10.002 0x-0.008 9，R2為0.999 1，有良好的線性關系。

2.2.2 IPTG對NK酶活力的影響

圖8 IPTG濃度對細胞生長的影響Fig. 8 Effects of IPTG concentration on cell growth

圖9 IPTG濃度對酶活力的影響Fig. 9 Effects of IPTG concentration on enzyme activity

Wang等[25]優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的實驗證明：葡萄糖、K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O對B. subtilis natto產NK起關鍵作用；Berenjian等[23]證明甘油促進NK表達。本實驗在文獻基礎上[22,24-28]，以酵母提取物為氮源進行發(fā)酵。

由圖8、9可知，IPTG濃度對工程菌細胞生長影響不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵45、50 h，在0.5 mmol/L和 1 mmol/L濃度下酶活力差異不顯著（P＞0.05），但兩者與0.2 mmol/L相比差異顯著；發(fā)酵54 h，3 個濃度差異不顯著（P＞0.05），IPTG濃度為0.5 mmol/L時酶活力相對最高。乳糖的類似物IPTG起誘導表達作用的同時還存在一定毒性，需控制在最適范圍內既提高表達量又不影響菌體生長，實驗選用IPTG濃度為0.5 mmol/L。

2.2.3 2,6-吡啶二羧酸對NK酶活力的影響

圖10 吡啶二羧酸濃度對酶活力的影響Fig. 10 Effects of pyridine dicarboxylic acid concentration on enzyme activity

2,6-吡啶二羧酸是存在于芽孢桿菌中的抗菌劑，它可提高滲透壓，有利于維持酶的構象，濃度適當可提高NK活力[26]，本實驗探究2,6-吡啶二羧酸濃度對酶活力的影響。由圖10可知，不同2,6-吡啶二羧酸濃度在各時間段對酶活力影響差異顯著（P＜0.05）。濃度從0.5 mmol/L增大到1.0 mmol/L時，主要起促進酶活力表達的作用，酶活力升高。濃度再增加到2.0 mmol/L后起抑制作用，酶活力降低。最終確定2,6-吡啶二羧酸最佳濃度為1 mmol/L。

2.2.4 發(fā)酵液濃度對NK酶活力的影響

圖11 誘導溫度和培養(yǎng)基濃度對細胞生長的影響Fig. 11 Effects of medium concentration and temperature on cell growth

圖12 25 ℃誘導溫度下培養(yǎng)基濃度對酶活力的影響Fig. 12 Effects of medium concentration on enzyme activity when the induction temperature was 25 ℃

圖13 30 ℃誘導溫度下培養(yǎng)基濃度對酶活力的影響Fig. 13 Effects of medium concentration on enzyme activity when the induction temperature was 30 ℃

確定IPTG和2,6-吡啶二羧酸添加量后，為提高NK表達量和提高菌體濃度，將發(fā)酵培養(yǎng)基濃度提高1 倍，結果如下：由圖11、12所示，在25 ℃條件下，培養(yǎng)基濃度對菌體量和酶活力的影響極為顯著（P＜0.01），培養(yǎng)基濃度增加可促進細菌生長和酶活力提高。其中發(fā)酵20 h時，B的菌體濃度和NK酶活力分別是A的3.3 倍和3.6 倍；25 h時，B的菌體濃度和NK酶活力分別是A的4.8 倍和5.4 倍；而在30 h時，比值分別為4.4 倍和6.6 倍。30 h時，酶活力最高為（156.00±2.04）U/mL。

由圖11和13所示，在30 ℃誘導溫度下，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的工程菌OD600nm和酶活力存在顯著差異（P＜0.05），其中發(fā)酵20 h時，以B為發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體濃度和NK酶活力分別是A的3.3倍和5.9倍；25 h時，比值分別為的2.8、8.5 倍；而在30 h時，比值分別為1.4 、11.5 倍。30 h時，酶活力最高為（224.00±3.08）U/mL。

在相同發(fā)酵培養(yǎng)基、兩個不同溫度下，菌體量和酶活力差異不顯著，但30 ℃菌體量和酶活力表達均較高，培養(yǎng)基濃度增加（發(fā)酵培養(yǎng)基B）提高菌體濃度，是酶活力增加的重要原因。同時，在相同菌體濃度下，酶的表達量有所提高。在發(fā)酵培養(yǎng)基B中培養(yǎng)時，菌體濃度的增加主要發(fā)生在25 h以前，而酶活力在此后還會增加，說明生長和產酶并不同步。

2.2.5 接種量對NK酶活力的影響

圖14 接種量對細胞生長的影響Fig. 14 Effects of inoculum concentration on cell growth

圖15 接種量對酶活力的影響Fig. 15 Effects of inoculum concentration on enzyme activity

由圖14可知，發(fā)酵21.5和45 h，不同接種量引起的菌體量差異不顯著，其中在20 h左右接種量為5% 時菌體量較低，接種量為2.5%和7.5%菌體量較大。由圖15可知，發(fā)酵21.5 h，不同接種量引起的酶活力差異顯著（P＜0.05），隨著發(fā)酵45 h，酶活力差異不顯著，但接種量越大，酶活力越高。其中當接種量為7.5%時酶活力平均最高值為（289.26±3.42）U/mL。

采用相同的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，未檢測出宿主菌B. subtilis 168中的酶活力，B. subtilis natto酶活力為（74.32±0.69）U/mL，工程菌B.s 168/pHT01-aprN酶活力是野生菌B. subtilis natto的3.9 倍，可見B.s 168/pHT01-aprN在很大程度上提高了酶活力。Wei Xuetuan等[27]構建的工程菌NK酶活力（工業(yè)法33.86 FU/mL）是原宿主菌WX-02的2.3 倍，在相同的酶活力測定方法（四肽底物法）下，B.s 168/pHT01-aprN搖瓶培養(yǎng)酶活力是Berenjian等[23]報道的野生菌NK酶活力（23.48 U/mL）的12.2 倍，是Kim等[28]報道的（13.5 U/mL）21.5 倍，大大提高NK胞外表達水平。Berenjian等[23]報道優(yōu)化培養(yǎng)基進行高密度發(fā)酵酶活力為587 U/mL，比搖瓶培養(yǎng)的野生菌酶活力（23.48 U/mL）提高25 倍；Cho等[29]高密度發(fā)酵的NK酶活力是搖瓶培養(yǎng)的5.4 倍，補料發(fā)酵再提高2.1 倍；Kwon等[30]高密度發(fā)酵的NK酶活力是搖瓶培養(yǎng)的5.0 倍，補料發(fā)酵再提高4.3 倍。以上文獻報道的結果對下一步進行高密度發(fā)酵提供有力支持。

3 結 論

本實驗采用pHT01載體，依據B. subtilis 密碼子的偏愛性，優(yōu)化編碼NK前30 個氨基酸的密碼子，實現(xiàn)優(yōu)化的aprN基因在B. subtilis 168中表達。通過酶活力比較，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：培養(yǎng)基成分（葡萄糖20 g/L、酵母提取物20 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、甘油2%，pH 8.0）、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L、IPTG 終濃度0.5 mmol/L、接種量7.5%、發(fā)酵誘導溫度30 ℃，該條件下NK最高酶活力為（289.26±3.42） U/mL，胞外NK酶活力為相同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的野生菌的3.9 倍，酶活力表達穩(wěn)定性良好。NK中加入了6 個組氨酸片段，有助于后續(xù)利用鎳柱親和層析進行純化。后續(xù)研究高密度發(fā)酵后對酶活力表達的影響。

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Construction of Genetically Engineered Strain for Nattokinase Production and Enzyme Activity Analysis

CUI Qing, QIAN Bingjun, YAO Xiaomin, JI Shunli, LU Feifeng, WU Jing, ZHANG Jianhua*
(Bor S. Luh Food Safety Research Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Nattokinase (NK), encoded by the aprN gene of Bacillus subtilis natto, has strong fibrinolytic activity both in vitro and in vivo. In this research, the aprN gene from B. subtilis was cloned and the codons which encode the first 30 amino acids were optimized on the basis of the codon preference of B. subtilis. Recombinant vector pHT01-aprN was constructed. Through restriction enzyme digestion analysis, PCR amplification and sequencing, the subcloned gene was confirmed to be aprN. The pHT01-aprN was transformed into B. subtilis 168 by electroporation, and the engineered bacterium (B.s 168/pHT01-aprN) was isolated on LB plates containing chloramphenicol. NK expression was induced by IPTG, and the highest enzyme activity in shaking flask culture was up to (289.00 ± 3.42) U/mL with good stability, which was 3.9 times as high as that of wild-type B. subtilis natto.

nattokinase; aprN gene; Bacillus subtilis; enzyme activity; engineered bacteria

10.7506/spkx1002-6630-201714001

Q786

A

1002-6630（2017）14-0001-08

崔青, 錢炳俊, 姚曉敏, 等. 納豆激酶基因工程菌的構建及酶活力分析[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 1-8. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714001. http://www.spkx.net.cn

CUI Qing, QIAN Bingjun, YAO Xiaomin, et al. Construction of genetically engineered strain for nattokinase production and enzyme activity analysis[J]. Food Science, 2017, 38(14): 1-8. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714001. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國家自然科學基金面上項目（31171737）

崔青（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：cuiqing1992@sina.com

*通信作者：張建華（1968—），男，副研究員，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：zhangjh@sjtu.edu.cn