翟 璐，于 琦，侯朵朵，劉馨晨，步洪石，孟佳啟，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

玉米黑粉菌的生物學(xué)特性研究

翟 璐，于 琦，侯朵朵，劉馨晨，步洪石，孟佳啟，王淑敏*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

探究不同碳源、氮源、微量元素、pH、溫度等對玉米黑粉菌菌絲生長的影響，選出適合玉米黑粉菌生長的條件。通過單因素試驗對菌絲形態(tài)、生長勢、生長速度進(jìn)行分析比較，選出適合玉米黑粉菌生長的最佳碳源、氮源、微量元素、pH和溫度。通過正交試驗優(yōu)化碳源、氮源、微量元素的比例。結(jié)果表明，最佳生長條件為葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%，pH6～7，溫度20℃～30℃。培養(yǎng)周期為4 d～7 d。通過對玉米黑粉菌的生物學(xué)特性研究，掌握其菌絲體生長、繁殖所適宜的營養(yǎng)條件及環(huán)境條件，為玉米黑粉菌的開發(fā)利用提供參考。

玉米黑粉菌；培養(yǎng)基；生長速度

玉米黑粉菌 [Ustilago maydis（DC．）Corda]屬于擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes） 黑粉菌目 （Ustilaginales）黑粉菌科（Ustilaginaceae） 黑粉菌屬（Ustilago）。玉米黑粉菌又叫玉米烏米，烏米是很多東北老輩兒小時候的一種回憶，而現(xiàn)在，很多年輕人也從長輩那聽到了烏米的營養(yǎng)價值，“烏米”還有很多響亮的名字，比如說墨西哥松露、玉米蘑菇、烏米等，不僅可以吃，還可以入藥。玉米黑粉菌幼嫩時可以食用，含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)（尤其是K、Fe、Se含量較高）、維生素、真菌多糖以及合理的必需氨基酸組成，玉米黑粉菌是開發(fā)保健食品的優(yōu)質(zhì)天然原料。

玉米黑粉菌可以加工藥用，性寒，味甘，具利肝臟、益脾胃和解毒通便作用，用于血虛，津液不足，口干舌燥，熱血氣陰兩傷，神經(jīng)衰弱，小兒疳積和肝病胃病。據(jù)文獻(xiàn)報道，其菌液對小白鼠肉瘤S180具有抑制作用。

玉米黑粉菌孢子近球形至球形，有時橢圓形或卵圓形，有微小刺，淡褐色，大小（8～12） μm×（7.5～11）μm。圖1和圖2分別為玉米黑粉菌孢子堆和孢子電鏡掃描圖片。本實驗供試菌株從玉米黑粉菌孢子堆中取孢子，經(jīng)分離純化為純種玉米黑粉菌菌種，并進(jìn)行生物學(xué)特性研究。

圖1 玉米黑粉菌孢子堆（圖片來自網(wǎng)絡(luò)）Fig.1 Sporus of Ustilago maydis(picture from the network)

圖2 玉米黑粉菌孢子（×5000）Fig.2 Spore of Ustilago maydis(×5000)

2 材料與方法

2.1 實驗材料與試劑

2.1.1 供試菌株

供試菌株由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥實驗室提供。葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖、酵母粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4NO3、MgSO4、CaCO3、KH2PO4、尿素、VB1、玉米粉、麥麩、豆餅粉，均來自于北京化工廠。

2.1.2 供試培養(yǎng)基組成

（1）碳源培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.10%、瓊脂2%，pH自然。

（2）氮源培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖3%、KH2PO40.15%、MgSO40.10%、瓊脂2%，pH自然。

（3）微量元素培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯汁20%、葡萄糖3%、蛋白胨2%、瓊脂2%，pH自然。

（4）正交優(yōu)化培養(yǎng)基

正交優(yōu)化培養(yǎng)基因素分別為葡萄糖、酵母粉、MgSO4、KH2PO4，按照表4的L9（34）不同比例配制培養(yǎng)基。

（5）pH試驗

馬鈴薯汁20%、葡萄糖1%、酵母粉1%、瓊脂2.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.15%。

（6）溫度試驗

馬鈴薯汁20%、葡萄糖1%、酵母粉1%、瓊脂2.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.15%。

2.2 實驗方法

菌種經(jīng)過篩選、分離、純化為純種玉米黑粉菌菌種?？疾旖M每組平行3只試管，按照實驗方法配制培養(yǎng)基，后經(jīng)過高壓滅菌并在無菌操作下分別接種0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊，于培養(yǎng)箱25℃避光培養(yǎng)。自萌發(fā)日開始每日記錄菌絲狀態(tài)，測量菌落面積，比較生長速度。

2.2.1 碳源

試驗設(shè)置6組平行，其中1組作為對照，其他組分別加入葡萄糖3%、蔗糖3%、木糖3%、乳糖3%、玉米面浸出液6%。

2.2.2 氮源

試驗設(shè)置8組平行，其中1組為對照，其他組分別加入酵母粉2%、麥麩浸汁5%、蛋白胨2%、尿素 0.2%、豆餅粉浸汁 4%、 (NH4)2SO40.2%、NH4NO30.2%。

2.2.3 微量元素

試驗設(shè)置7組平行，其中1組為對照，其他組分別加入MgSO40.10%、KH2PO40.15%、CaO 0.1%、NaH2SO40.15%、VB10.05%、MgSO40.10%、KH2PO40.15%。

2.2.4 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗篩選結(jié)果，按L9（34）設(shè)計四因素三水平配制9組不同培養(yǎng)基，配方見表1。

2.2.5 pH

根據(jù)優(yōu)化的培養(yǎng)基結(jié)果，采用0.1 mol·L-1HCL和20%NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。

2.2.6 溫度

表1 L9（34）正交試驗培養(yǎng)基優(yōu)化因素和水平Tab.1 Orthogonal experimental of L9(34)on medium optimization factors and levels

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配制5組相同的培養(yǎng)基，分別放在設(shè)置溫度為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 結(jié)果分析

3.1 碳源

不同碳源對玉米黑粉菌菌絲生長的影響見表2、圖3。

圖3 不同碳源條件下玉米黑粉菌生長速度Fig.3 Growth rate of Ustilago maydis with different carbon sources

從表2和圖3可以看出，碳源為葡萄糖的菌絲長勢旺盛，菌絲潔白、厚、致密、均勻，菌落邊緣整齊，氣生菌絲合適，無雜菌污染且生長速度最快。玉米黑粉菌菌絲生長的碳源宜選擇葡萄糖。

表2 不同碳源對菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different carbon sources on mycelia growth

3.2 氮源

不同氮源對玉米黑粉菌菌絲生長的影響見表3、圖4。

表3 不同氮源對菌絲生長的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on mycelia growth

根據(jù)表3和圖4結(jié)果，氮源為酵母粉時菌絲潔白、致密、厚、均勻，長勢旺盛，菌落邊緣較整齊，氣生菌絲合適，無雜菌污染且生長速度最快。玉米黑粉菌生長的最佳氮源宜選擇酵母粉。

3.3 微量元素

不同微量元素對玉米黑粉菌菌絲生長的影響情況見表4、圖5。

根據(jù)表4、圖5的分析，當(dāng)微量元素是MgSO4和KH2PO4時，菌絲狀態(tài)最佳，長勢旺盛，菌落邊緣整齊，氣生菌絲較合適，無雜菌污染，生長速度最快。玉米黑粉菌的微量元素選擇MgSO4和KH2PO4。

表4 不同微量元素對菌絲生長的影響Tab.4 Effects of different trace elements on mycelia growth

圖4 不同氮源條件下玉米黑粉菌生長速度Fig.4 Growth rate of Ustilago maydis with different nitrogen sources

3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗篩選結(jié)果，按L9（34）正交設(shè)計，結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

圖5 不同微量元素對玉米黑粉菌菌絲生長的影響Fig.5 Effects of different trace elements on mycelia growth of Ustilago maydis

表5 L9(34)正交試驗表及結(jié)果Tab.5 L9(34)orthogonal experimental table and results

根據(jù)表6方差分析表，可知KH2PO4使結(jié)果具有顯著性差異（P＞0．05），通過表5中極差大小分析可知，4種影響因素對結(jié)果的影響順序為KH2PO4＞葡萄糖＞MgSO4＞酵母粉。正交優(yōu)化結(jié)果為葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%。

表6 斜面培養(yǎng)基優(yōu)化方差分析表Tab．6 Optimization of variance of slant medium

3.5 不同pH對菌絲生長的影響

不同pH對菌絲生長的影響結(jié)果見表7、圖6。

表7 不同pH對菌絲生長的影響Tab．7 Effects of different pH values on mycelia growth

圖6 不同pH條件下玉米黑粉菌生長速度Fig．6 Growth rate of Ustilago maydis with different pH values

圖7 不同溫度條件下玉米黑粉菌生長速度Fig．7 Growth rate of Ustilago maydis with different temperatures

根據(jù)表7、圖6，玉米黑粉菌在pH為6～7的范圍內(nèi)均能以較快速度生長。生長速度顯示其生長能力強，中性以及中性偏酸的條件，更適合它的生長。

3.6 不同溫度對菌絲生長的影響

不同溫度對菌絲生長的影響結(jié)果見圖7、表8。

從圖7、表8可以看出，玉米黑粉菌在20℃～30℃的范圍內(nèi)均能生長。溫度低于20℃或者高于30℃均可以抑制它的生長，這在實際生活中具有重要意義。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)果

從試驗結(jié)果可知，玉米黑粉菌的最適碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉，最適宜生長的微量元素選擇KH2PO4和MgSO4。正交優(yōu)化試驗優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖1%、酵母粉1%、MgSO40．1%、KH2PO40．15%。玉米黑粉菌在pH為6～7和溫度20℃～30℃的條件下均能以較快速度生長。

表8 不同溫度對菌絲生長的影響Tab．8 Effects of different temperature on mycelia growth

4.2 討論

培養(yǎng)條件中葡萄糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4均經(jīng)濟易得，適合玉米黑粉菌的生長，玉米黑粉菌對環(huán)境條件適應(yīng)性強。酵母粉除提供氮源外，還提供大量的無機鹽及生長因子，但有機氮源來源不穩(wěn)定，成份復(fù)雜，所以利用有機氮源時要考慮到原料波動對發(fā)酵的影響。試驗篩選出適合于菌絲體培養(yǎng)和菌種保藏的條件，為玉米黑粉菌菌絲體液體培養(yǎng)及成分提取、分離奠定基礎(chǔ)。

[1]石太淵，王霽，孫大為，等．玉米黑粉菌多糖提取工藝研究[J]．食品科技，2007（2）：142-144，150．

[2]石太淵，孫大為，張銳，等．玉米黑粉菌的加工利用分析[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工：學(xué)刊，2006（9）：28-30，32．

[3]王永斌，王允祥．玉米黑粉菌培養(yǎng)條件響應(yīng)面法優(yōu)化研究[J]．中國釀造，2006（5）：56-60．

[4]王輝，斯琴格日樂，馬端輝，等．玉米黑粉菌孢子粉的無機元素和氨基酸含量測定[J]．菌物研究，2006（1）：20-23．

[5]石太淵，姜福林，張華，等．玉米烏米營養(yǎng)成分分析[J]．食品科技，2006（1）：136-138．

[6]費尚芬，李紅梅，王守理，等．玉米黑粉菌多糖發(fā)酵的初步研究[J]．食品科學(xué)，2002（11）：83-85．

著作權(quán)轉(zhuǎn)讓聲明

全體著作權(quán)人：

全體著作權(quán)人同意：論文發(fā)表在《中國食用菌》上，自論文發(fā)表之日起，該文的復(fù)制權(quán)、發(fā)行權(quán)、信息網(wǎng)絡(luò)傳播權(quán)、匯編權(quán)在全世界范圍內(nèi)免費轉(zhuǎn)讓給《中國食用菌》編輯部。

論文的著作權(quán)人保證：

（1）論文是著作權(quán)人獨立取得的原創(chuàng)性研究成果；論文內(nèi)容不涉及國家機密；

（2）未曾以任何形式、用任何文種在國內(nèi)外公開發(fā)表過；

（3）論文的內(nèi)容不侵犯他人著作權(quán)和其他權(quán)利，否則著作權(quán)人將承擔(dān)由于論文內(nèi)容侵權(quán)而產(chǎn)生的全部責(zé)任，并賠償由此給《中國食用菌》編輯部造成的全部損失。

并承諾：

（1）以后不將以任何形式在其他任何地方發(fā)表該論文；

（2）此聲明對全體著作權(quán)人均有約束力；

（3）著作權(quán)人保證其本人具有代表其他著作權(quán)人做出各項承諾之權(quán)利。

注：不同意上述轉(zhuǎn)讓聲明的著作權(quán)人，在收到論文刊用通知5日內(nèi)書面回復(fù)《中國食用菌》編輯部。

Study on the Biological Characteristics of Ustilago maydis

ZHAI Lu,YU Qi,HOU Duo-duo,LIU Xin-chen,BU Hong-shi,MENG Jia-qi,WANG Shu-min
(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Effects of different carbon sources,nitrogen sources,trace elements,pH value and temperature on mycelial growth of Ustilago maydis were studied,and the conditions suitable for the growth of U.maydis were selected．The optimal carbon source, nitrogen source,trace element,pH and temperature were selected for the growth of strain by single factor investigation．The proportion of the carbon source,nitrogen source,trace elements were optimized by orthogonal experiment．The optimum growth conditions were glucose of 1%,yeast powder of 1%,MgSO4of 0．1%,KH2PO4of 0．15%,pH of 6-7,temperature of 20℃-30℃．The incubation period is 4 d-7 d．The biological characteristics of U.maydis were studied to understand the suitable nutrient conditions and environmental conditions of mycelium growth and reproduction,and to provide reference for the development and utilization of U.maydis．

Ustilago maydis;culture medium;growth rate

S646.9

A

1003-8310（2017）04-0026-06

10．13629/j．cnki．53-1054．2017．04．007

翟璐（1993-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為中藥分析。E-mail:174759250＠qq．com

*通信作者：王淑敏（1965-），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用微生物物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效學(xué)研究以及中藥分析學(xué)研究。E-mail: 446097156＠qq．com

2017-05-12