華東地區(qū)藍(lán)莓采后病害病原鑒定及其多樣性分析

尉瑩瑩+梁晨+趙洪海+李寶篤

摘要：本試驗以采自山東省日照市、青島市及威海市和浙江省金華市的藍(lán)莓果實為試材， 通過對采后病害病原菌的分離、鑒定、致病性測定及多樣性分析，探究地區(qū)間藍(lán)莓采后病原菌種類及其群落特征。分離鑒定結(jié)果表明：引起藍(lán)莓采后病害的病原菌有鏈格孢（Alternaria alternata）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、根霉（Rhizopus sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger ）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）、擬莖點霉（Phomopsis sp.）、枝狀枝孢（Cladosporium cladosporioides）、輻毛小鬼傘（Coprinellus radians）、稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）、球黑孢（Nigrospora sphaerica）、棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）等12種真菌。多樣性分析結(jié)果表明，藍(lán)莓采后病原菌群落多樣性豐富，其中鏈格孢是優(yōu)勢種，灰葡萄孢和根霉是亞優(yōu)勢種；4個采樣地藍(lán)莓采后病原真菌群落的多樣性存在差異，其中金華地區(qū)的多樣性指數(shù)（H′=1.5540）和均勻度指數(shù)（J=0.9658）均最高；4個地區(qū)間的藍(lán)莓采后病原菌相似性系數(shù)較低，其中日照地區(qū)與青島地區(qū)之間的相似性系數(shù)最高（Cj=0.4444），威海地區(qū)與金華地區(qū)之間的相似性最低（Cj=0.1428）。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；采后病害；病原菌數(shù)量；種類組成；優(yōu)勢種；多樣性指數(shù)；相似性系數(shù)

中圖分類號：S436.639 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0112-04

Abstract The blueberry fruits collected from Rizhao， Qingdao， Weihai of Shandong Province and Jinhua of Zhejiang Province were used as experimental materials in this test. In order to explore the species and community characteristics of blueberry postharvest pathogens from different origins， the isolation， identification， pathogenicity determination and diversity analysis of pathogens were carried out. The results showed that the blueberry postharvest rot diseases were caused by the following twelve fungi： Alternaria alternata， Botrytis cinerea， Rhizopus sp.， Aspergillus niger， Epicoccum nigrum， Pestalotiopsis microspora， Phomopsis sp.， Cladosporium cladosporioides， Coprinellus radians， Nigrospora oryzae， Nigrospora sphaerica and Pestalotiopsis clavispora. The diversity analysis results demonstrated that there was rich diversity in the blueberry postharvest pathogen community， of which， Alternaria alternata was the dominant species， and Botrytis cinerea and Rhizopus sp. were the subdominant species. There were obvious differences in postharvest fungal pathogen community diversities among four blueberry sampling sites， and Jinhua was the highest in Shannon diversity index （H′=1.5540） and Pielou evenness index （J=0.9658）. The similarity coefficients of blueberry postharvest pathogens among the four regions were low， among which， the similarity coefficient between Rizhao and Qingdao was the highest （Cj=0.4444）， while that between Weihai and Jinhua was the lowest （Cj=0.1428）.

Keywords Blueberry； Postharvest disease； Pathogen quantity； Specific composition； Dominant species； Diversity index； Similarity coefficient

藍(lán)莓（Vaccinium spp.），屬于杜鵑花科 Vacciniaceae越橘屬 Vaccinium，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價值的新興世界性小漿果果樹[1]。果實中含有豐富的維生素、多種氨基酸，還含有花青素、黃酮等多種酚類成分，上述成分導(dǎo)致藍(lán)莓具有很強(qiáng)的抗氧化性及改善循環(huán)、提高免疫力、抗衰老、抗癌等多種生理活性功能[2]，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是抗氧化性最強(qiáng)的水果之一，常被譽(yù)為“漿果之王”[3]。

藍(lán)莓含水量高，采后果實易發(fā)生失水、腐爛等現(xiàn)象，極不耐貯藏[4]。這一特性限制了其商品貨架期和商品價值。近年來，國內(nèi)對藍(lán)莓貯藏保鮮技術(shù)研究較多，但對采后病害的研究報道較少。2016年戴啟東等[5]報道遼寧地區(qū)引起藍(lán)莓采后病害的主要致病菌為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、鏈格孢（Alternaria sp.）、青霉（Penicillium sp.）及粉紅單端孢（Trichothecium roseum）；2015年周笑犁等[6]報道貴州地區(qū)引起藍(lán)莓采后病害的主要致病菌為擬盤多毛孢（Pestalotiopsis sp.）、新梭殼孢Neofusicoccum sp.、青霉（Penicillium sp.）、地霉（Geotrichum sp.）及枝頂孢（Acremonium sp.）；2015年郭曉月等[7]報道云南地區(qū)引起藍(lán)莓貯藏期病害的致病菌為枝孢屬（Cladosporium ）、鏈格孢屬（Alternaria）及匍柄霉屬（Stemphylium）真菌；2010年梁晨等[8]報道藍(lán)莓貯藏期病害有灰葡萄孢、草酸青霉（Penicillium oxalicum）、褐孢霉（Fulvia fulvum）、鏈格孢（A. alternata）及基連枝頂孢（A. kiliense）。本研究以從華東四地采摘的藍(lán)莓果實為研究對象，對引起藍(lán)莓采后病害病原菌的種類和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為有效防治藍(lán)莓采后病害提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年6—8月間，從山東省的日照市、青島市、威海市及浙江省的金華市采摘成熟度相同、大小均勻的藍(lán)莓鮮果。

1.2 藍(lán)莓采后病害病原菌的分離與純化

將果實放在25℃下貯藏，待果實自然發(fā)病后，按常規(guī)組織分離法[9]在發(fā)病果實病健交界處切取小塊病組織，移在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，待長出菌落后，采用玻璃毛細(xì)管分離法[9]進(jìn)行單菌絲純化，并保存菌株在PDA斜面上備用。

1.3 藍(lán)莓采后病害病原菌致病性測定

參考趙淑艷等（2005）[10]的方法加以改良，分別采用有傷接種法和無傷接種法進(jìn)行病原致病性測定。有傷接種法為選取成熟度和大小一致的果實用2%次氯酸鈉浸泡5 min，用無菌水洗凈，晾干，用昆蟲針在果實果蒂處刺直徑3 mm、深3 mm的傷口。將純化好的病原菌，在PDA上培養(yǎng)7 d，待其產(chǎn)孢后，分別用無菌水制成1×106個/mL的孢子懸浮液。在每個果實傷口處接種10 μL孢子懸浮液。無傷接種法為直接接種相應(yīng)病原菌的1×106 個/mL孢子懸浮液10 μL到果蒂處。以接種無菌水為對照，每處理10個果實，設(shè)3個重復(fù)。接種后將果實置于塑料盒中，25℃下保濕培養(yǎng)。7 d后觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 藍(lán)莓采后病害病原菌鑒定

根據(jù)病原菌在PDA上的菌落形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征，參照真菌鑒定手冊[11]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的通用引物ITS1和ITS4[12]以及相應(yīng)的PCR條件對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對病原菌進(jìn)行分子鑒定。

1.5 多樣性分析

分離頻率用于比較和判斷病原菌的優(yōu)勢種群，計算公式：分離頻率（%）= 某一分離物的總數(shù)（株）/所有分離物總數(shù)（株）×100；各地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌群落的多樣性水平通過香農(nóng)威納指數(shù)（Shannon-Weiner index，H′）、Pielou均勻度指數(shù)（Pielous evenness index，J）及Margalef豐富度指數(shù)（D）進(jìn)行分析，計算公式：H′=-∑si=1Pi×lnPi ；J= H′/Hmax，Hmax=-∑si=11/S×ln1/S = lnS，J=H/lnS；D=（S-1）/lnN，式中，Pi是第i種的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例，N為總個體數(shù)，S為每個樣品中的物種總數(shù)。

1.6 相似性分析

地區(qū)間藍(lán)莓采后病原真菌群落組成的相似性水平通過Jaccrad相似性指數(shù)（Cj）來進(jìn)行分析，其公式為：Cj=c/（a+b-c），式中，a、b分別為兩種生境類型中病原菌種數(shù)，c為兩種生境類型中共有的病原菌種數(shù)，用于比較兩個生境中病原菌種類組成的相似程度[13，14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓采后病原菌種類與分離頻率

由表1可知，從華東四市采集的藍(lán)莓果實中所分離的采后病害的病原微生物均為真菌，共計212株，分屬10 屬12 種，其中，鏈格孢是優(yōu)勢種，其分離頻率為71.70%；灰葡萄孢和根霉是亞優(yōu)勢種，分離頻率分別為9.91%和5.66%；黑曲霉、黑附球菌、小孢擬盤多毛孢及擬莖點霉是第三大優(yōu)勢種群，分離頻率分別為3.30%、2.83%、2.36%及1.42%；枝狀枝孢、棒狀擬盤多毛孢、稻黑孢、輻毛小鬼傘及球黑孢的分離頻率均少于1.00%，是藍(lán)莓采后病原菌的稀有種群。

由表2可知，不同地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌群落組成和結(jié)構(gòu)存在一定差異。在四個采集地中，日照藍(lán)莓采后病原真菌的種類最多，為6屬7種，其優(yōu)勢種群是鏈格孢，占日照總菌株數(shù)的相對分離頻率為81.43%；從青島藍(lán)莓分離出采后病原真菌5屬6種，其優(yōu)勢種群為鏈格孢，其次為灰葡萄孢和根霉，分別占青島總菌株數(shù)的相對分離頻率63.93%、16.39%及13.11%；從威海藍(lán)莓中分離出采后病原真菌3屬3種，其優(yōu)勢種群為鏈格孢，其次為灰葡萄孢，分別占威?？偩陻?shù)的相對分離頻率86.67%和10.00%；從金華藍(lán)莓分離出采后病原真菌5屬5種，其優(yōu)勢種群為黑曲霉，占金華總菌株數(shù)的相對分離頻率為33.33%。

2.2 致病性測定

無傷接種7 d后，致病性測定結(jié)果表明，藍(lán)莓果實均不發(fā)病，說明藍(lán)莓果實采后在不受外傷的情況下，病原菌很難侵染果實。

由表3可見，有傷接種均能使果實發(fā)生不同程度的腐爛，其中鏈格孢、灰葡萄孢、根霉和黑曲霉引起的發(fā)病率為100%，小孢擬盤多毛孢、擬盤多毛孢和枝狀枝孢引起的發(fā)病率在70%～80%，其他病原菌引起的發(fā)病率在55%及以下。分別從有傷接種的發(fā)病果實上進(jìn)行病原菌的再分離和培養(yǎng)，其分離率均為100%，未分離到非接種菌，說明發(fā)病藍(lán)莓的腐爛是由所接種病原菌菌株侵染所致。

2.3 不同地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌多樣性特點

表4可見，四個地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌群落間的多樣性水平存在差異。從病原真菌的數(shù)量上看，日照地區(qū)的最高，共分離出7種真菌，而威海地區(qū)的最低，僅分離到3種真菌；從多樣性水平來看，日照地區(qū)真菌的豐富度指數(shù)（D）最高，金華地區(qū)真菌的多樣性指數(shù)（H′）和均勻度指數(shù)（J）均最高，分別為1.5540、0.9658。

2.4 不同地區(qū)間藍(lán)莓采后病原真菌組成的相似性

表5可見，四個地區(qū)間藍(lán)莓采后真菌群落相似性系數(shù)在0.1428～0.4444之間，日照與青島兩地藍(lán)莓采后病原真菌群落相似性最高（0.4444），威海與金華兩地藍(lán)莓采后病原真菌群落相似性最低（0.1428）。根據(jù)Jaccrad相似性原理，各地區(qū)之間的真菌群落相似性系數(shù)處于極不相似與中等不相似之間?？傮w來看，四個地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌群落間的相似度均較低。

3 討論與結(jié)論

多樣性指數(shù)可用來分析病原菌群落的多樣性，均勻度指數(shù)是反映病原菌種群分布特點的重要指標(biāo)，豐富度指數(shù)可用來反映病原菌種屬豐富性特點，而相似性系數(shù)是反映兩個不同地區(qū)間病原菌群落組成相似程度的重要指數(shù)。本研究對華東兩省四市藍(lán)莓典型代表產(chǎn)地進(jìn)行分析，從四個產(chǎn)地的藍(lán)莓果實中分離和鑒定出10屬12種病原真菌，并且發(fā)現(xiàn)栽培地區(qū)不同，藍(lán)莓采后病原菌數(shù)量、組成及群落多樣性水平的差異較大，相似程度較低。

物種多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)與各地區(qū)的氣候、土壤條件、當(dāng)?shù)氐纳a(chǎn)管理水平密切相關(guān)。山東三個產(chǎn)地雖然分布在沿海，但由于青島和日照的空氣潔凈度低于威海，因此威海藍(lán)莓果實采后病原真菌種類最少，而浙江金華的藍(lán)莓產(chǎn)地地處山地，雖然周圍的植物病原真菌較多，導(dǎo)致藍(lán)莓采后病原真菌種類多于威海，但分離真菌菌株數(shù)最少；同時相對于其他三地，威海氣溫較低，也導(dǎo)致采后病原真菌多為不耐高溫的真菌種類。同時鏈格孢和灰葡萄孢比較適合低溫，是山東三地的優(yōu)勢種，而在黑曲霉更適應(yīng)高溫，因此是金華地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌中的優(yōu)勢種。金華地區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)及豐富度指數(shù)均較高，說明該地區(qū)的環(huán)境適合空氣微生物發(fā)生和繁殖。從真菌組成相似性來看，日照和青島的相似性最高，威海與金華最低，說明威海與金華之間真菌組成差異性較大。

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