杜美琳，張 毅，白 雪，彭 揚，何 平

mTOR抑制劑雷帕霉素對肺癌LK2細胞的抑制作用

杜美琳，張 毅，白 雪，彭 揚，何 平*

目的 觀察mTOR抑制劑雷帕霉素對肺癌LK2細胞生長的影響。方法 LK2細胞在0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L不同濃度的雷帕霉素組以及0 μmol/L雷帕霉素空白對照組作用下，采用MTT比色法檢測細胞生長情況，流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡改變。結(jié)果 雷帕霉素能夠抑制LK2細胞增殖，且具有時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。流式細胞儀檢測提示，雷帕霉素各濃度組均可以促進肺癌細胞LK2凋亡，且隨著雷帕霉素濃度的升高，LK2細胞凋亡率逐漸增加。結(jié)論 雷帕霉素對肺癌LK2細胞有抑制作用。

雷帕霉素；mTOR抑制劑；LK2細胞；凋亡

0 引言

近年來，肺癌的發(fā)病率明顯升高，其被臨床診斷時，多為中晚期，生存率極低。其目前對于不能手術(shù)治療的肺癌患者，其藥物治療的研究仍然需要進一步探討。

哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是影響腫瘤細胞增殖表達的作用靶點。雷帕霉素是mTOR抑制劑，雖然已有研究證明其對腫瘤細胞的抑制作用，但雷帕霉素對不同腫瘤細胞株可能產(chǎn)生不同的影響[1-2]。目前，對于雷帕霉素抑制肺癌LK2細胞株及其對細胞周期的抑制等方面研究報道仍然較少。本實驗通過使用雷帕霉素作用于肺癌細胞株LK2，觀察細胞的生長和周期變化狀態(tài)，為抗肺癌藥物的實際臨床應(yīng)用提供一些實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 人肺癌LK2細胞由中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物教研室提供。雷帕霉素購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；胰蛋白酶購自以色列Biological Industries公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司；胎牛血清購自天津索萊寶生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇人肺癌LK2細胞株，采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃下，體積分?jǐn)?shù)比例為5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)LK2細胞。培養(yǎng)過程中嚴(yán)格遵守實驗操作規(guī)范，避免污染。每隔3～4 d傳代，棄去培養(yǎng)瓶中的陳舊培養(yǎng)基，使用0.25%胰蛋白酶進行消化，消化液充分接觸瓶底細胞后，在顯微鏡下觀察，待細胞的胞質(zhì)回縮變圓，即棄掉消化液，使用PBS沖洗2次，加入含胎牛血清的培養(yǎng)基停止細胞繼續(xù)被消化，用吸管輕輕吹打使細胞脫離培養(yǎng)皿壁且均勻分布后，分別裝入其他培養(yǎng)瓶中，傳代培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT法檢測LK2細胞增殖抑制率 消化并且收集對數(shù)增殖期肺癌LK2細胞，調(diào)整成濃度為1×105/mL的細胞懸液，接種于96孔的培養(yǎng)板，在培養(yǎng)板的每個孔中分別加入100 μL的細胞懸液，設(shè)置3個復(fù)孔，并設(shè)空白對照。接種的LK2細胞培養(yǎng)過夜后，在顯微鏡下認(rèn)真觀察確認(rèn)LK2細胞的貼壁狀態(tài)良好，棄去上清。實驗組中加入稀釋的雷帕霉素藥物,使其在每個孔的最終濃度依次為0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L。實驗另設(shè)含全培養(yǎng)基的空白對照以及未加入雷帕霉素作用的陰性空白對照。之后，培養(yǎng)板中的LK2細胞在恒定溫度(37 ℃)下、飽和濕度、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別再繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每次在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，MTT 20 μL加入到培養(yǎng)孔中，繼續(xù)在37 ℃下孵育4 h，用吸管小心吸去上清，分別加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL,振蕩10 min，使藥物混勻，終止反應(yīng)后使用酶標(biāo)儀，檢測波長為570 nm的各孔光吸收值，計算細胞增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。按公式計算細胞增殖抑制率：抑制率=[1-加藥組OD值/對照組OD值]×100%。

1.2.3 檢測雷帕霉素作用下LK2細胞凋亡的程度 使用流式細胞儀(FCM)AnnexinV/PI雙染法分析雷帕霉素誘導(dǎo)LK2細胞凋亡，將細胞以5×105接種于12孔板中,分別加入終濃度為1、4 μmol/L的雷帕霉素溶液，設(shè)空白對照組(加等量RPMI-1640培養(yǎng)基)，于37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后應(yīng)用胰酶消化收集細胞，4 ℃、1 500 r/min離心5 min，更好地收集細胞、棄清培養(yǎng)基，且需冷PBS洗滌離心的細胞2次。用500 μL 1×Binding Buffer讓細胞懸浮，形成濃度約為1×106/mL的細胞懸液。在懸浮細胞液中加入5 μL×AnnexinV-FITC輕搖混勻，再加入5 μL PI輕晃搖勻，于2～8 ℃避光條件下作用15 min。在1 h內(nèi)應(yīng)用流式細胞儀進行檢測。結(jié)果應(yīng)用Cellquest專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測雷帕霉素對LK2細胞增殖的影響 隨著雷帕霉素作用濃度的增加和作用時間的延長,其對LK2細胞的增殖有明顯的抑制作用,均呈現(xiàn)明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。

圖1 MTT檢測雷帕霉素對LK2細胞增殖的影響

2.2 流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測藥物誘導(dǎo)細胞凋亡 藥物雷帕霉素作用24 h，隨著濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例都逐漸增加，實驗組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 流式細胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測藥物誘導(dǎo)細胞凋亡

3 討論

雷帕霉素又稱西羅莫司，1975年研究者從南太平洋的一座島上的土壤中發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)出雷帕霉素的吸水鏈霉菌，其產(chǎn)出的雷帕霉素具有大環(huán)內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)，因此最初的雷帕霉素是被當(dāng)作一種低毒性的抗生素，未引起重視。之后，由于雷帕霉素具有良好的免疫抑制活性，在1999年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，作為器官移植排異反應(yīng)抑制劑上市。隨著對雷帕霉素的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有抗腫瘤細胞增殖的作用，其在實驗中使用雷帕霉素作用于喉癌細胞、乳腺癌細胞、腎癌細胞、膀胱癌細胞、骨肉瘤細胞等多種器官的腫瘤細胞，均提示有一定的腫瘤抑制作用[3-6]，但效果不盡相同[7]，且只有少數(shù)進入了臨床前期試驗[8]。本研究選用非小細胞肺癌細胞株LK2作為實驗對象，觀察分析雷帕霉素對肺癌細胞增殖的抑制作用，增加了雷帕霉素作用于肺癌的不同細胞株研究。本實驗采取0.25～8 μmol/L不同濃度的雷帕霉素作用于LK2細胞，結(jié)果提示雷帕霉素可以抑制肺癌LK2細胞增殖，且抑制作用具有時間和劑量依賴性，為雷帕霉素治療肺癌臨床試驗的開展提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

雷帕霉素能夠靶向阻斷mTOR相關(guān)蛋白的表達，提示雷帕霉素可靶向抑制腫瘤細胞增殖[9]。已有研究表明，mTOR高度表達的腫瘤細胞多呈現(xiàn)為惡性腫瘤，正常細胞中mTOR亦可表達，但為低度表達，mTOR在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展中均有一定作用[10]。mTOR抑制劑不僅可以抑制癌細胞增殖、生長，還可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、減少腫瘤血管新生成[11-13]，已成為研究的一個熱點方向，因此，研究開發(fā)雷帕霉素的抗腫瘤作用、探討其在肺癌治療中的作用非常有意義[14]。mTOR與衰老疾病調(diào)節(jié)有關(guān)，是衰老過程中的調(diào)節(jié)因子，主要與mTOR信號通路在細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持的功能有關(guān)[15]。mTOR信號通路異常引起的細胞增殖、腫瘤生長和細胞代謝的過程復(fù)雜[16]，細胞通過自噬作用維持細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，mTOR包括2種復(fù)合物：mTORC1、mTORC2，其中，mTORC1可以調(diào)節(jié)細胞增殖、生長和自噬等過程[17]，雷帕霉素則通過影響mTOR通路中的mTORC1[18]，誘導(dǎo)自噬作用的發(fā)生，使細胞維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤細胞的增長，成為研究抗癌和延長正常細胞壽命的一個要點。但雷帕霉素在治療過程中存在不良反應(yīng)，如免疫抑制作用和延遲發(fā)育等[19]。雷帕霉素已作為免疫抑制劑應(yīng)用于臨床，其抑制作用良好，因此，如何使其在抗癌過程中避免或產(chǎn)生最小不良反應(yīng)，同時選擇合適的應(yīng)用劑量，仍需要更多的實驗數(shù)據(jù)觀察探索。

綜上所述，雷帕霉素可以抑制肺癌LK2細胞，本研究為探討雷帕霉素在不同腫瘤細胞中及肺癌不同細胞株抗瘤效果的差異提供了參考，為針對治療腫瘤設(shè)計用藥方案提供了實驗依據(jù)。

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Inhibitory effects of rapamycin on lung cancer LK2 cells

DU Mei-lin,ZHANG Yi,BAI Xue,PENG Yang,HE Ping*

(Department of Geriatric Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To observe the effect of rapamycin on the growth of LK2 cells in lung cancer.Methods LK2 cells were evaluated by MTT assay and flow cytometry to detect their growth and apoptosis in different concentrations of rapamycin groups and blank control group.Results Rapamycin could inhibit the proliferation of LK2 cells and had a time-dose effect relationship. Flow cytometry result showed that the apoptosis ratio of LK2 cells increased with the increase of rapamycin concentration in the experiment.Conclusion Rapamycin has an inhibitory effect on lung cancer LK2 cells.

Rapamycin;mTOR inhibitor;LK2 cells;Apoptosis

2017-04-10

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽 110004

盛京自由研究者計劃(201205)

10.14053/j.cnki.ppcr.201707003

*通信作者