徐佳，王沂，翁新楚，吳正鈞

1(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海，200444)2(光明乳業(yè)股份有限公司 乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海，200436)

Paenibacillusbovissp. nov.BD3526作為益生菌的潛力

徐佳1,2，王沂1*，翁新楚1，吳正鈞2

1(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海，200444)2(光明乳業(yè)股份有限公司 乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海，200436)

對Paenibacillusbovissp. nov. BD3526作為益生菌的潛力進行了體外活性初步研究。采用模擬胃液、腸液、不同濃度的膽鹽環(huán)境，測定BD3526菌株在酸性及高膽鹽環(huán)境的存活率，并測試BD3526對金黃色葡萄球菌、藤黃、枯草芽孢桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，BD3526可以耐受pH值為2.0、3.0、4.0的人工胃液、pH8.0的模擬腸液以及0.1%、0.2%、0.3%的膽鹽環(huán)境；對金黃色葡萄球菌、藤黃、枯草芽孢桿菌有顯著的抑制能力。說明BD3526在人工消化液環(huán)境中具有良好的存活能力，不具有溶血作用；可引起敏感菌細(xì)胞滲漏，達到殺滅部分細(xì)菌，包括金色葡萄球菌的作用，因此，該菌具備作為益生菌應(yīng)用的潛力。

類芽孢桿菌BD3526；人工消化液；拮抗作用；益生菌

益生菌 (probiotics)是以活菌形式攝入一定數(shù)量后，對宿主健康具有明確改善作用的單一或組成確定的混合微生物(WHO/FAO，2002)。作為益生菌，必須無毒性、無致病作用，能耐受胃酸和膽鹽，以活菌形式到達腸道，并能在消化道表面定殖。

研究表明，抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了抗生素相關(guān)腹瀉(AAD)、抗藥性等一系列不良后果。益生菌通過調(diào)節(jié)免疫、改善腸道微生態(tài)平衡、提高機體抵抗力以及治療AAD，可以有效地減少抗生素在預(yù)防感染性疾病等方面的使用量。較其他益生菌而言，類芽孢桿菌作為益生菌具有更大的優(yōu)勢，如應(yīng)用的安全性、抗菌活性強[1]、生長速度快、穩(wěn)定性高[2]等優(yōu)點，目前，我國允許使用的類芽孢桿菌數(shù)量較少，因此，開發(fā)具有益生功能的新型類芽孢桿菌成為熱點。

本研究中使用的Paenibacillusbovissp. nov.BD3526(牛類芽孢桿菌)是從中國西藏的牦牛生奶中分離得到，基于16S rRNA和全基因組序列比較的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該菌株屬于類芽孢桿菌屬的一個新種[3]。BD3526利用麩皮可以產(chǎn)生具有高活力的凝乳酶，在干酪生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用潛力[4]，BD3526可以合成大量的左聚糖苷(levan)，該多糖可以促進淋巴細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達，表明其具有作為天然免疫調(diào)節(jié)劑的潛力[5]。本研究采用模擬胃腸液和膽汁環(huán)境，測定BD3526菌株在胃酸和高膽鹽環(huán)境下的耐受性，并對其安全性及抑菌作用進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

本研究所用菌種為Paenibacillusbovissp. nov.BD3526(CGMCC 8333=DSM 22170)，指示菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC1.879，藤黃微球菌(Micrococcusluteus) CGMCC1.1848，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CMCC63501，均由乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)CGMCC1.9136。

1.1.2 培養(yǎng)基

TYC培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15，酵母抽提物5，蔗糖50，乙酸鈉20，NaCl 1，NaHCO32，無水Na2SO40.1，L-胱氨酸0.2，Na2HPO4·12H2O 2。

BHI培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、脫水小牛腦浸粉12.5、脫水牛心浸粉5.0、C6H12O62、NaCl 5、Na2HPO42.5。

營養(yǎng)肉湯(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 10。

MRS肉湯(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸膏10，酵母膏5，C6H12O620，C6H17N3O72，乙酸鈉5，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，K2HPO42。

TPY培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15，酵母提取物4、C6H12O610、KH2PO46、K2HPO4·3H2O 2、Na2CO32、NaCl 2。

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0，大豆胨3.0。

固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉，培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌15 min 后備用。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PB-10 pH計，美國Sartorius公司；AVANTI J30I高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司；HZQ-X 500C恒溫振蕩器、HZQ-X500C搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴槽，英國Grant公司；Sorvall Stratos臺式高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Bioscreen C，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限；Spectra M5酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，HIRAYAMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 最適生長培養(yǎng)基的篩選

Paenibacillusbovissp. nov.BD3526以相同接種量接種于不同培養(yǎng)基中，每隔30 min用Bioscreen C測定OD600值，共測24h。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.2 胃液腸液耐受性試驗

10%的HCl加PBS(g/L，NaCl 8、KCl 0.2、Na2HPO41.44 和KH2PO40.24)，使pH 值分別為2、3、4, 在100 mL PBS溶液中加0.3 g胃蛋白酶(800～2 500 U/mg，Sigma，USA)，充分溶解后用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌作為人工胃液[6]。每100 mL PBS(pH 7.8)中加入0.1 g胰蛋白酶(250 U/mg，Sigma，USA)充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌作為模擬小腸液[7]。

將收集的細(xì)胞重懸于無菌生理鹽水(0.85% NaCl，w/v)中。將細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×109CFU/mL至模擬胃液(pH 3.0)。在37℃下孵育1、2和3 h。胃液處理3 h后，將1 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到9 mL模擬腸液(pH 8.0)中，并在37℃孵育。為了評價小腸運輸耐受性，在2、4和8 h后取出1 mL培養(yǎng)物，進行活菌計數(shù)[8]，按公式(1)計算存活率，其中每個樣品做3個重復(fù)。

(1)

式中：A1，胃液/腸液處理組的活菌數(shù)；A0，初始時的活菌數(shù)。

1.2.3 最低膽鹽抑菌濃度(MIC)的測定

將BD3526接種至膽鹽含量為0.1%～1%的TYC固體培養(yǎng)基，30 ℃好氧培養(yǎng)，觀察其生長狀況。

1.2.4 膽鹽耐受性

在生理鹽水中添加濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%的豬膽鹽[9]，過濾除菌后，加入新鮮制備的BD3526菌懸液，調(diào)節(jié)活菌濃度在1×108CFU/mL左右，37℃下孵育6 h。按一定時間取樣，進行10倍系列稀釋，采用TYC瓊脂30℃培養(yǎng)48 h，進行活菌計數(shù)。按公式(2)計算BD3526在不同濃度膽鹽的存活率，每個樣品做3個重復(fù)。

(2)

式中：B1，添加特定濃度膽鹽后處理組的活菌數(shù)；B0，在該濃度膽鹽BD3526的初始活菌數(shù)。

1.2.5 溶血性試驗[10]

將保存在-80℃的Paenibacillusbovissp. nov. BD3526采用TYC固體培養(yǎng)基30 ℃，24 h活化，活化3代后，接種于血平板，30 ℃好氧培養(yǎng)24 h，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)。

1.2.6 抑菌活性的測定

采用雙層瓊脂平板法對Paenibacillusbovissp. nov. BD3526進行抑菌活性的測定。將BD3526點種在特定平板中央，培養(yǎng)24 h后，將混有指示菌的半固體培養(yǎng)基覆蓋在其表面，使最終指示菌濃度為106CFU/mL左右，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.7Paenibacillusbovissp. nov. BD3526對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用

向蜂窩板中分別加入TSB液體培養(yǎng)基150 μL，接入處于對數(shù)生長期的BD3526菌液25 μL(108CFU/mL)，金黃色葡萄球菌菌液25 μL(108CFU/mL)。BD3526對金黃色葡萄球菌生長采用Bioscreen C系統(tǒng)以及與之相連的EZExperiment軟件來監(jiān)測。在Bioscreen C系統(tǒng)中將細(xì)菌培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，每隔30 min記錄1次OD600值。

1.2.8 細(xì)胞外核酸蛋白的檢測

取培養(yǎng)至對數(shù)期的Paenibacillusbovissp. nov. BD3526種子液10 mL，離心取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌作為樣品。取培養(yǎng)至對數(shù)期的金黃色葡萄球菌10 mL，離心收集菌體，重懸于BHI培養(yǎng)基中。然后將5 mL BD3526種子液上清、5 mL金黃色葡萄球菌菌懸液與10 mL BHI培養(yǎng)基在100 mL的三角瓶中混合，調(diào)整金黃色葡萄球菌菌濃度為108CFU/mL，以無菌水代替BD3526種子液上清作對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每30 min取1 mL菌液，離心取上清，用酶標(biāo)儀測定OD260和OD280值，共測量6 h。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制核酸/蛋白釋放曲線。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)前處理，用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1Paenibacillusbovissp. nov.BD3526最適生長培養(yǎng)基的篩選

通過比濁法對BD3526在不同的培養(yǎng)基中的生長狀況進行比較，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，篩選出最適合BD3526生長的培養(yǎng)基，如圖1，BD3526在TYC培養(yǎng)基中生長狀態(tài)最佳，8 h左右進入對數(shù)期，18 h左右進入穩(wěn)定期，到24 h培養(yǎng)結(jié)束。通過活菌計數(shù)，TYC、BHI培養(yǎng)基中活菌濃度可以達到109CFU/mL，活菌數(shù)高于其他培養(yǎng)基，而BD3526在TSB中出現(xiàn)緩慢的生長，在MRS培養(yǎng)基中則不生長。因此，在后續(xù)研究BD3526耐受人工消化液及抑菌作用中，選取TYC、BHI和TSB作為主要的培養(yǎng)介質(zhì)。

圖1 P.bovis sp. nov. BD3526在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of P.bovis BD3526 in different media

2.2 耐胃酸、腸液試驗結(jié)果

人體消化道的正常pH值范圍為2～8[11]，其中，胃液的pH值在進食前后變化很大，空腹時的極端pH值可低至1.5。因此，作為益生菌，首先需要具有耐受胃酸環(huán)境的能力。人體的消化過程一般為4 h左右，其中，食物在胃部的排空時間為2 h左右，因此，選取3種不同pH值的胃液(pH2～4)處理3 h，來觀察BD3526在人工胃腸液中的存活性能。

食物由胃進入小腸后，即開始小腸內(nèi)的消化，小腸內(nèi)消化是整個消化過程中重要的階段, 也是各種益生菌制劑發(fā)揮作用的場所。小腸液的pH約為pH7.6，益生菌只有經(jīng)受住小腸液的作用、保持一定數(shù)量的存活菌數(shù)時才能發(fā)揮作用。本實驗取處理3 h后pH3的胃液0.5 mL，加入4.5 mL模擬小腸液，從而考察BD3526對腸道環(huán)境的耐受性，經(jīng)過腸液處理4h，觀察BD3526存活情況。

表1試驗結(jié)果表明：在低pH值胃液中，隨著處理時間延長，BD3526的活菌數(shù)呈減少趨勢，pH值越低，BD3526活菌數(shù)下降越明顯。經(jīng)pH4.0的胃液處理3h后，BD3526存活率達到93.14%，pH3條件下，存活率達到90.36%，pH2條件下，存活率達到87.97%，說明BD3526對胃酸環(huán)境具有一定的耐受性。將經(jīng)過不同pH值胃液處理后的BD3526細(xì)胞，進一步采用人工腸液處理，結(jié)果見表2。隨著處理時間的增加，BD3526的活菌數(shù)變化并不明顯，表明BD3526具有良好的腸道耐受性能。

表1 不同pH模擬胃液中P.bovis sp. nov. BD3526的存活情況

表2 人工腸液中P.bovis sp. nov. BD3526的存活情況

2.3 耐膽鹽試驗結(jié)果

2.3.1 MIC值

表3試驗結(jié)果表明，BD3526在不同膽鹽添加量的TYC固體平板上生長5d后，其在0.1%～0.5%膽鹽含量范圍內(nèi)均可以生長；而高于0.5%膽鹽含量，菌體的生長則被抑制。因此，BD3526菌體最多可以耐受0.5%的膽鹽含量。

2.3.2 膽鹽耐受性

BD3526攝入后必須經(jīng)過人體的高胃酸環(huán)境和十二指腸的高膽鹽環(huán)境，才能充分發(fā)揮它們的益生效應(yīng)，維持人體腸道菌群平衡[12]。十二指腸的膽鹽濃度為0.3～3 g/kg[13]，而食物通過十二指腸的時間相對極短，因此人的胃腸道屬于高酸高膽汁鹽環(huán)境[14]。膽鹽為人體肝臟分解膽固醇時所產(chǎn)生的一種表面活性劑，其功能為幫助脂肪及脂溶性維生素的消化吸收，但膽鹽濃度過高會抑制體內(nèi)微生物的生長活動。對益生菌而言，耐受體內(nèi)高膽鹽環(huán)境、以活菌形式進入腸道是一個非常關(guān)鍵的特性。

表3 膽鹽的最低抑菌濃度值

人體不同部位膽汁酸的濃度會有一定的變化，通常為0.3%～0.5%，因此，通常將耐受0.3%膽鹽含量作為選擇益生菌的標(biāo)準(zhǔn)之一。人體內(nèi)存在多種類型的膽鹽，主要為牛磺膽鹽和甘氨膽鹽。該實驗?zāi)M人體的高膽汁環(huán)境，設(shè)定培養(yǎng)時間6 h，研究BD3526對膽鹽環(huán)境的耐受性。

表4 不同濃度膽鹽環(huán)境中P.bovis sp. nov.BD3526的存活情況

試驗結(jié)果如表4所示，在不同膽鹽添加量下，BD3526經(jīng)膽鹽處理，活菌數(shù)較對照組有下降趨勢，但下降并不明顯，在0.3%膽鹽環(huán)境下處理6 h后，BD3526存活率仍高達90.13%。結(jié)果表明BD3526對人體消化系統(tǒng)的高膽鹽環(huán)境具有一定的耐受力，可以到達并定殖于動物腸道，從而發(fā)揮其促進作用。

2.4 溶血性

檢測Paenibacillusbovissp. nov. BD3526的溶血性。由圖2可見，BD3526菌落周圍沒有出現(xiàn)溶血圈，初步表明其具有一定的安全性。

圖2 P.bovis sp. nov. BD3526不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象Fig.2 No hemolytic activity was observed for P.bovis BD3526 on blood agar

2.5 抑菌性

2.5.1 抑菌活性的測定

采用雙層瓊脂平板法，將BD3526點種在平板中間，調(diào)整指示菌濃度在106CFU/mL，恒溫培養(yǎng)24h，觀察其抑菌效果。由圖3可見：BD3526對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌均有明顯的抑制效果。

A-金黃色葡萄球菌；B-藤黃微球菌；C-枯草芽孢桿菌；D-單增李斯特菌圖3 P.bovis sp. nov. BD3526對不同細(xì)菌的拮抗作用Fig.3 Antagonistic activity of P.bovis BD3526 against some other bacteri

2.5.2 對金黃色葡萄球菌生長的影響

益生菌可以通過多種方式拮抗其他微生物。目前認(rèn)為，在腸道微生態(tài)系統(tǒng)中，益生菌可通過產(chǎn)生有機酸、細(xì)菌素及過氧化氫等物質(zhì)抑制病原菌，或通過空間占位、營養(yǎng)競爭、替代和排斥等方式，減少腸道病原菌對腸道上皮組織的吸附，從而降低腸道疾病的發(fā)生。劉玉娟[15]等研究表明，Paenibacillusbovissp. nov. BD3526可以產(chǎn)生一種細(xì)菌素類的物質(zhì)抑制藤黃球菌的生長。圖4表明，在TSB培養(yǎng)基中，當(dāng)BD3526與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，可以抑制金黃色葡萄球菌的生長。

圖4 P.bovis sp. nov. BD3526對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.4 P.bovis BD3526 influence on the growth of Staphylococcus aureus

2.6 細(xì)胞外核酸蛋白的檢測

經(jīng)上清處理后的胞外核酸和蛋白含量變化曲線見圖5。在0～1.5 h，與對照組相比，OD260與OD280值均無明顯變化，表明在此階段金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞膜仍然保持完整性，胞內(nèi)物質(zhì)沒有外泄；1.5 h后，OD260與OD280明顯上升趨勢，表明在此階段菌體細(xì)胞膜可能受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)外漏。由此得出，BD3526可能是通過作用金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，使其形成孔洞，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而起到殺菌的作用。

圖5 胞外核酸、蛋白含量的變化Fig.5 Changes of extracellular nucleic acid and protein

3 討論

益生菌是指當(dāng)攝入足夠量時能對人體產(chǎn)生有益作用的活的微生物，益生作用包括緩解乳糖不耐受、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、降低血液膽固醇水平、調(diào)節(jié)機體免疫力等。根據(jù)世衛(wèi)組織(WHO/FAO)對益生菌的定義，只有滿足如下要求的菌株才能稱之為益生菌，包括：胃酸耐受性、膽汁酸抗性、對黏液或人上皮細(xì)胞的黏附能力、對潛在致病菌的抑菌能力、降低病原菌在表面黏附的能力、膽汁鹽水解能力等。

益生菌要進入消化道起作用，首先應(yīng)該能夠耐受較低pH值的酸性環(huán)境。由肝臟分泌到十二指腸的高濃度膽鹽具有抗菌活性，對細(xì)胞膜有很強的破壞力，它的疏水作用可導(dǎo)致膜蛋白離解和細(xì)胞膜破裂。故益生菌要順利進入動物腸道，除具有可耐受胃中低pH值的能力外，還需具備耐受小腸中膽汁等形成的高滲透壓環(huán)境的能力，小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%波動。本試驗中BD3526對胃酸、腸液和膽鹽都表現(xiàn)出較強的耐受性，將能夠存活到達腸道。

溶血性是體外評價菌株安全性的重要指標(biāo)之一[16]。根據(jù)菌株不同的溶血特征可將溶血性分為兩類：α溶血，其特點是菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血圈，對人體的致病力差；β溶血，其特點是菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血圈，對人體的致病力強。若未有溶血性，則是沒有溶血圈出現(xiàn)的γ溶血。本實驗發(fā)現(xiàn)BD3526無溶血圈出現(xiàn)，說明BD3526不具有溶血性。ARGYRI[17]的試驗發(fā)現(xiàn)4株乳桿菌雖具有較強的生物活性，但出現(xiàn)α溶血，不具備安全性，不可以作為益生菌使用。

在前期劉玉娟[15]等報道的基礎(chǔ)上，本研究進一步探索了BD3526對胃酸、人工消化液耐受性、溶血作用及對部分細(xì)菌的拮抗作用。結(jié)果表明，BD3526不具有溶血作用，初步表明其具有較高的安全性；同時，BD3526表現(xiàn)出良好的耐受胃腸道環(huán)境的性能，可以通過使敏感菌細(xì)胞滲漏，具有抑制或殺滅包括金色葡萄球菌在內(nèi)的部分細(xì)菌。因此，Paenibacillusbovissp. nov. BD3526具備作為益生菌的潛力。

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Assessment ofPaenibacillusbovissp.nov. BD3526 as a potential probioticsinvitro

XU Jia1,2，WANG Yi1*，WENG Xin-chu1，WU Zheng-jun2

1(School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444,China)2(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology，Research Institute of Bright Dairy and Food Co. Ltd.，Shanghai 200436，China)

To investigate the potential ofPaenibacillusbovissp.nov. BD3526 as a probioticsinvitro, the growth of the strain BD3526 in different media, i.e. TYC and BHI broths was investigated. The survivals of BD3526 cells under different levels of bile salts (0.1% to 0.3% (w/v)), in simulated gastric juice with varied pH values (pH 2 to 4) and in simulated intestinal juice were determined. Furthermore, the mechanism involved in the antagonistic activity of the strain BD3526 againstStaphylococcusaureusthrough lysis of the indicator cells was also assayed. BD3526 displayed strong antagonistic activity to some bacteria including opportune pathogen, e.g.Staphylococcusaureusand good survival ability in simulated gastric juice as well as intestinal juice. No hemolytic activity was observed for the strain BD3526 on blood agar.Paenibacillusbovissp.nov. BD3526 was demonstrated to be a potential probiotics.

Paenibacillusbovissp.nov. BD3526；simulated gastrointestinal juice；antagonistic；probiotics

碩士研究生(王沂博士為通訊作者，E-mail:wangyi201@163.com)。

“十二五”國家科技支撐計劃課題：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開發(fā)(2013BAD18B01) ；上海市科委項目：上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心(16DZ2280600)；上海市閔行區(qū)重大產(chǎn)業(yè)技術(shù)攻關(guān)項目：無添加發(fā)酵乳的研究與開發(fā)(2015MH093)

2017-01-11，改回日期：2017-02-08

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706003